曹景文，任玲，王秋紅，匡海學(xué)

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040； 2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

廣陳皮為蕓香科植物茶枝柑(CitrusreticulataChachi)及其栽培變種的成熟干燥果皮，是廣東道地藥材，其性味苦、辛、溫。歸肺、脾經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，用于治療脘腹脹滿、食少吐泄、咳嗽痰多[1]。廣陳皮含有豐富的黃酮和多糖類成分，其總多糖含量為41.5%[2]。目前對(duì)于廣陳皮黃酮類成分研究居多，多糖類成分雖為其主要成分之一，但研究尚少。研究表明，多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等生物活性，且無(wú)毒、無(wú)抗藥性作用[3]。近年來，有許多關(guān)于中藥多糖對(duì)正常小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究，無(wú)論免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑都可能在機(jī)體免疫過程中的不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生不同的作用[4-5]。本文探討廣陳皮多糖對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)小鼠免疫功能的影響及對(duì)正常小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Neofuge 1600/1600R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force)；FJY1002-UVF純水儀(青島富勒姆科技)；MX-F渦旋混合器(Servicebio)；DFD-700水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司)；Epoch酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bio TeK)；ME802/02電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 主要藥品與試劑

廣陳皮總多糖(自制)：準(zhǔn)確稱取40 g廣陳皮粗粉，加10倍量95%(φ)乙醇溶液，回流脫脂，干燥。加蒸餾水24∶1加熱回流提取3次，合并濾液濃縮，加3倍量95%乙醇溶液，混勻，靜置，抽濾得沉淀物。Sevage法脫蛋白，濃縮凍干得廣陳皮總多糖，測(cè)得總多糖含量為2.8%。

地塞米松磷酸鈉注射液(DXM)(批號(hào)14012518，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司)；水合氯醛(批號(hào)20180813)、注射用環(huán)磷酰胺(Cy，批號(hào)C804838)、二硝基氟苯(DNFB，批號(hào)F830061)(上海麥克林生化科技有限公司)；Mouse IL-2(批號(hào)70-EK202/2-96)、IL-4(批號(hào)70-EK204/2-96)、IFN-γ(批號(hào)70-EK180-48)ELISA Kit(聯(lián)科生物有限公司)；橄欖油(批號(hào)0108685，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；PBS緩沖液(批號(hào)P1022，北京索萊寶科技有限公司)；注射用生理鹽水(批號(hào)11100852，廣東利泰制藥股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠90只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：44005800008651，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0034。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 廣陳皮總多糖對(duì)DNFB誘導(dǎo)DTH模型小鼠的作用

小鼠腹部皮膚去毛約2 cm2區(qū)域，用微量移液器取1.5% DNFB[溶于ξ(橄欖油∶丙酮)=1∶1中]100 μL，均勻滴加于脫毛區(qū)致敏。于致敏當(dāng)天開始，小鼠按各組給藥方式給藥，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，用微量移液器取1.5% DNFB 20 μL，均勻滴加于小鼠右耳前后兩面致敏[6]。

取小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、廣陳皮總多糖低劑量組、高劑量組，每組10只?？瞻讓?duì)照組和模型組按0.1 mL/10 g 0.9%NaCl溶液灌胃給藥；陽(yáng)性對(duì)照組按10 mg/(kg·d)1、3、5 d皮下注射DXM；廣陳皮總多糖低、高劑量組分別按50、200 mg/(kg·d)灌胃給藥。模型組和廣陳皮總多糖低、高劑量組每天灌胃給藥1次，共7 d。

2.2 廣陳皮總多糖對(duì)正常小鼠的作用

BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分成4組，每組10只：空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、廣陳皮總多糖低劑量組、高劑量組?？瞻讓?duì)照組用0.1 mL/10 g 0.9%NaCl溶液灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組按30 mg/(kg·d)1、3、5 d皮下注射Cy；廣陳皮總多糖低、高劑量組分別按50、200 mg/(kg·d)灌胃給藥，每天灌胃給藥1次，共7 d。

2.3 耳腫脹度的計(jì)算

致敏后24 h之后稱體質(zhì)量，5%(φ)水合氯醛麻醉小鼠，脫頸椎處死，分別剪下雙耳，對(duì)齊雙耳用6 mm打孔器在相同部位打下圓耳片，稱質(zhì)量，左、右耳片質(zhì)量差為其腫脹度。

2.4 脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

致敏后24 h稱重小鼠，5%水合氯醛麻醉，脫頸椎致死，取脾與胸腺稱重。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量×10/體質(zhì)量

2.5 血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的測(cè)定

致敏后24 h稱重小鼠，5%水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球取血。全血標(biāo)本在室溫放置2 h后，1 000g離心15 min，吸出上清至1.5 mL離心管，放入-80 ℃冰箱備用，按試劑盒說明書對(duì)IL-2、IL-4和IFN-γ含量進(jìn)行測(cè)定。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 廣陳皮總多糖對(duì)各組小鼠耳腫脹的影響

結(jié)果見圖1。模型組小鼠耳腫脹度與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示DNFB引起的DTH造模成功，陽(yáng)性對(duì)照組(DXM)小鼠右耳的腫脹度與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。廣陳皮總多糖高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

小鼠耳腫脹度/%15105012345***##

1.空對(duì)照白組； 2.模型組； 3.陽(yáng)性藥組(DXM)； 4.廣陳皮多糖高劑量組； 5.廣陳皮多糖低劑量組。(下圖同)

與空白對(duì)照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖1廣陳皮總多糖對(duì)各同組小鼠耳腫脹的影響

Figure1Effect of total polysaccharides on ear swelling in different groups of mice (n=10)

3.2 各組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

模型組和空白對(duì)照組比較，臟體系數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽(yáng)性藥組和廣陳皮總多糖高劑量組與模型組比較，臟體系數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；廣陳皮總多糖低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明高劑量廣陳皮多糖對(duì)DNFB所致DTH反應(yīng)有明顯的抑制作用，見圖2。

0.060.040.020.00臟體指數(shù)1234512345AB****##

A.脾指數(shù); B.胸腺指數(shù)。與空白對(duì)照組比較：#P<0.05； 與模型組比較：*P<0.05。

圖2各組小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)值
Figure2Spleen index and thymus index in each group

3.3 廣陳皮總多糖對(duì)DTH型小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

如圖3所示，模型組同空白組比較，細(xì)胞因子的含量均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，IL-2、IFN-γ、IL-4差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，說明造模成功；DXM和廣陳皮多糖高劑量組抑制了DTH模型小鼠IL-2、IL-4細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使其含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，廣陳皮多糖低劑量組與模型對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。廣陳皮多糖高低劑量組IFN-γ含量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

12345AB**#1234512345細(xì)胞因子含量/(pg?mL-1)403020100C##***#*

A. IL-2; B. IL-4; C. IFN-γ。與空白對(duì)照組比較：#P<0.05，##P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖3廣陳皮總多糖對(duì)DTH型小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

Figure3Effect of total polysaccharides on serum cytokines in DTH mice

3.4 廣陳皮總多糖對(duì)正常小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

如表1，陽(yáng)性藥組與空白對(duì)照比較，細(xì)胞因子IL-2和IL-4的含量呈現(xiàn)稍降低趨勢(shì)，廣陳皮多糖高、低劑量組與空白對(duì)照相比，細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的含量呈現(xiàn)輕微升高趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 廣陳皮總多糖對(duì)正常小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

Table1Effect of total polysaccharides on serum cytokines in normal miceρ/(pg·mL-1)

分組劑量/(mg·kg-1)IL-2 IL-4 IFN-γ空白對(duì)照組-10.05±3.238.89±1.4231.09±2.08陽(yáng)性藥組309.99±3.138.21±1.2431.06±2.91廣陳皮多糖 高劑量組5010.57±1.429.17±1.0231.84± 3.15 低劑量組20010.94±1.979.25±1.7131.47±4.61

4 討論

DNFB是一種半抗原，其誘導(dǎo)的DTH是由特異性致敏T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，又稱接觸性過敏反應(yīng)[7]，是指抗原進(jìn)入機(jī)體使T細(xì)胞致敏，當(dāng)再次接觸相同致敏原后，特異性T淋巴細(xì)胞釋放炎性因子，引起炎癥[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組小鼠耳腫脹、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯增高，細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的含量也有所提高。由此可見DTH模型小鼠制備成功。

胸腺、脾臟是機(jī)體主要免疫器官，是免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所。胸腺是重要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化、發(fā)育的場(chǎng)所，參與細(xì)胞免疫[9]。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，可以清除衰老細(xì)胞和微生物等物質(zhì)，其中的大量T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在機(jī)體防御和清除功能中具有重要作用[10]。因此測(cè)定胸腺和脾臟指數(shù)能反映免疫功能。本實(shí)驗(yàn)中廣陳皮總多糖高劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著下降，其結(jié)果顯示機(jī)體淋巴細(xì)胞損傷或凋亡，說明廣陳皮總多糖可降低DTH模型小鼠細(xì)胞免疫功能。另外，高劑量廣陳皮總多糖可顯著降低小鼠的耳腫脹度，說明廣陳皮總多糖對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

IL-2是控制T細(xì)胞分化、存活和功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子[11]，是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)極為重要的淋巴因子[12]，用于治療丙型肝炎病毒誘導(dǎo)的血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。IL-4是T細(xì)胞自身分泌的細(xì)胞因子，主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的分化上，能夠與多種引起炎癥的細(xì)胞因子相互作用，參與機(jī)體自身的免疫反應(yīng)[13]，人與小鼠IL-4 DNA水平上有70%同源性。IFN-γ具有抗病毒，抗腫瘤和免疫調(diào)控的作用，當(dāng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)T細(xì)胞(TDTH)活化時(shí)，釋放IFN-γ，可進(jìn)一步活化APC，提高抗原提呈率[14]。本實(shí)驗(yàn)中高劑量廣陳皮總多糖可顯著降低DTH模型小鼠血清中的IL-2、IL-4含量，但對(duì)正常小鼠的細(xì)胞免疫幾乎無(wú)影響。在DTH中IL-2、IL-4等在反應(yīng)中起了重要作用，能誘導(dǎo)肥大細(xì)胞產(chǎn)生釋放組胺、趨化因子等，對(duì)加重皮膚炎癥有重大作用。DTH模型小鼠血清中IL-2、IL-4含量的下降，說明廣陳皮多糖可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制作用，但對(duì)正常機(jī)體的免疫平衡系統(tǒng)無(wú)影響。

綜上所述，廣陳皮多糖通過抑制Th1和Th2分泌的細(xì)胞因子的產(chǎn)生達(dá)到抑制DTH小鼠免疫反應(yīng)程度，廣陳皮多糖高劑量組能較好地減輕DTH。其具有作為安全免疫調(diào)節(jié)劑的潛力，有可能用于治療與T細(xì)胞功能異常相關(guān)的一些自身免疫性疾病，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究為廣陳皮總多糖進(jìn)一步開發(fā)免疫抑制劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。