劉萍，白云，武傳秀，何曉桐，蘇昊達(dá)，郭林巖

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)多起源于腺管上皮,發(fā)病隱匿，侵襲性強，是一種發(fā)病率和治愈率低的惡性腫瘤疾病[1]。近年來報道，由于環(huán)境和飲食習(xí)慣的影響，其死亡率逐年上升[2]。由于胰腺癌早期難發(fā)現(xiàn)，手術(shù)和放、化療等手段患者5年內(nèi)生存率較差[3]，給患者帶來越來越多身體與精神上的痛苦。因此，開發(fā)有效地治療胰腺癌的藥物是目前醫(yī)藥研究的熱點課題，日益受到醫(yī)藥研究人員的重視。

ERK通路參與調(diào)控細(xì)胞惡變，以及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[4]。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲等過程，都與ERK通路密切相關(guān)。有研究表明，ERK通路可能參與了惡性腫瘤細(xì)胞的耐藥過程[5]。消化系統(tǒng)腫瘤胰腺癌，其惡性程度極高。胰腺癌細(xì)胞的耐藥性、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖等過程都與ERK通路關(guān)系密切[7]。

蝙蝠葛堿(Dau)又稱北豆根堿，是從中藥北豆根中提純出的有效單體成分[4]。在前期工作的大量積累上[8-10]，本實驗從體外培養(yǎng)BxPC-3細(xì)胞株入手，用Dau對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并從基因和蛋白水平對ERK信號通路的關(guān)鍵因子Raf和MEK1進(jìn)行檢測，探討Dau對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的增殖和遷移抑制作用與ERK信號通路的相關(guān)性。為多方面、多手段治療胰腺癌奠定實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗細(xì)胞

人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株來自于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑

Dau溶液(成都曼思特生物科技有限公司)；5-FU溶液(美國Sigma公司)；5 mg/mL MTT溶液(美國Sigma公司)；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；青霉素及鏈霉素(美國HyClone公司)；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純級。

1.3 主要儀器

實時熒光定量PCR檢測儀T100(美國伯樂公司)；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)模系統(tǒng)(美國Bio Rod公司)；1-6P低速離心機(jī)(無錫瑞江分析儀器有限公司)；Qi3536血細(xì)胞計數(shù)器(上海安信光學(xué)儀器制造有限公司)；310型CO2培養(yǎng)箱超凈工作臺(力康發(fā)展公司)；BS124S型分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將處于對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞BxPC-3用胰蛋白酶進(jìn)行消化。調(diào)至濃度為1×105個/mL的單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液。分4組分別給藥，給藥后再次放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用。

2.2 藥物劑量與實驗分組

應(yīng)用胰蛋白酶對處于對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3進(jìn)行消化。再用PBS液清洗3次，并且制成濃度為1×105個/mL的單細(xì)胞懸液。分別接種于4個培養(yǎng)瓶，間隔24 h后從培養(yǎng)箱取出。棄去培養(yǎng)液分組給藥：Dau高劑量組為終質(zhì)量濃度48 μg/mL的Dau培養(yǎng)液；Dau低劑量組為終濃度24 μg/mL的Dau培養(yǎng)液；5-FU組為終濃度50 μg/mL的5-FU培養(yǎng)液；Control組為常規(guī)培養(yǎng)液。給藥后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h。

2.3 細(xì)胞劃痕實驗

用油性筆在6孔板背面劃線每孔保證不少于3條，每條線間隔0.5～1 cm。用移液槍將培養(yǎng)好的細(xì)胞移入孔中并放于37 ℃、5%(φ)CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出。用移液槍頭垂直6孔板背面的橫線進(jìn)行劃痕。以PBS液洗滌各孔，重復(fù)洗3次。在除去劃掉的細(xì)胞后，按“2.2”方法分別給藥。每組再次各設(shè)4個復(fù)孔，2 d后，每間隔24 h對劃痕位置進(jìn)行拍照記錄。位置隨機(jī)，以上步驟重復(fù)2～3次。使用E-Ruler圖像處理軟件測出劃痕距離。以劃痕愈合百分比反映BxPC-3細(xì)胞株的遷移運動能力。

2.4 MTT法檢測胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3的細(xì)胞增殖

取上述終濃度的單細(xì)胞懸液，分別取100 μL滴加于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，進(jìn)行給藥干預(yù)。給藥后放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱48 h。每組各設(shè)6個復(fù)孔，每孔加液量為100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)44 h后，向各培養(yǎng)孔滴加10 μL的MTT(5 mg/mL)溶液。再次培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，向各孔滴加100 μL的DMSO。置于搖床震蕩直至結(jié)晶物溶解。調(diào)節(jié)波長至490 nm，檢測各孔的吸光度A值。重復(fù)進(jìn)行3次，分析給藥組對BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(1-實驗組A值/Control組A值)×100%

2.5 Real-time PCR法檢測BxPC-3細(xì)胞中Raf mRNA和MEK1 mRNA的表達(dá)

按Trizol試劑盒說明書抽提總RNA，從總RNA中吸取2 μL，與98 μL的DEPC水使其稀釋50倍。應(yīng)用紫外分光光度計，以DEPC水調(diào)零，測定RNA的濃度和純度。按PrimeScripr RT試劑盒說明書，進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，引物具體序列如下：Raf基因(上游：5′-GTGGATGAT GCCTTTGCTCG-3′,下游：5′-CCATCGGCGTTCCC ATACTT-3′);MEK1基因(上游：5′-CCGCTCAAA TACCTTCACAA-3′,下游：5′-ATTACGGATTTGGTCG TATTGG-3′);GAPDH基因(上游：5′-AACGGATTT GGTCGTATTGG-3′,下游：5′-TGGAAGATGGTGAT GGGATT-3′)。

PCR反應(yīng)條件：從第2階段，共擴(kuò)增40個循環(huán)。收集反應(yīng)過程中的熒光信號，應(yīng)用光學(xué)系統(tǒng)軟件(iQ 5)進(jìn)行分析。檢測各樣品的循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)，其Ct值與模板濃度成反比。將所有樣品設(shè)3個復(fù)孔，取平均Ct值并重復(fù)3次。分析其產(chǎn)物的SYBR熔解曲線，判斷PCR反應(yīng)的特異性?？傻贸瞿康幕?Raf、MEK1)對比內(nèi)參基因(GAPDH)的表達(dá)量?！鳌鰿t=△Ct(給藥組樣品)-△Ct(未給藥組樣品)；給藥組樣品目的基因和未給藥組樣品目的基因之間的表達(dá)差異為2-△△Ct倍。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

2.7 Western blot法檢測BxPC-3細(xì)胞中Raf蛋白和MEK1蛋白的表達(dá)

按蛋白抽提試劑盒說明書操作，提取總蛋白，以微孔酶標(biāo)儀法，測定總蛋白濃度。依照BCA濃度測定試劑盒說明書操作，測得蛋白濃度。計算出所需細(xì)胞抽提試劑、Buffer的用量。最終確定以5 μL Marker與各組蛋白樣品分別加入孔中。空孔加5×SDS上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(75 V，1 h)，嚴(yán)格按照跑膠順序及操作步驟進(jìn)行。將電轉(zhuǎn)槽放于冰浴中(水、冰袋)，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(75 V，2 h)，取出NC膜后，可見預(yù)染的Marker條帶，加一抗(5%脫脂牛奶稀釋)后，封住新薄膜袋。棄一抗，以TBST搖床洗膜10 min(重復(fù)3次)，移至二抗工作液中，置于分子雜交箱(UVP)，以37 ℃孵育1 h。棄二抗，以TBST搖床洗膜10 min(重復(fù)3次)。暗室關(guān)閉日光燈后，向NC膜滴加超敏發(fā)光液。蓋上保鮮膜，對應(yīng)放上X光膠片(剪掉上角標(biāo)記)。蓋上暗盒計時，曝光后放入顯影液觀察。搖動膠片至顯影后，放入定影液。清水沖洗后，分類保存膠片。掃描膠片得到圖形，由Image-pro plus軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與GAPDH吸光度的比值(目的蛋白A值/GAPDH A值)，來表示蛋白的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 Dau對BxPC-3細(xì)胞遷移能力的影響

表1顯示，Dau高、低劑量組愈合百分比分別為28.24%、33.28%，5-FU組愈合百分比34.20%，各組與Control組比較，愈合百分比均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果見圖1。

Control5-FUD24D480h24h48h

圖1 細(xì)胞劃痕實驗圖片F(xiàn)igure 1 Picture of cell scratch experiment

與Control組比較：**P<0.01。

3.2 Dau對胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3細(xì)胞增殖的影響

表2實驗結(jié)果表明，Dau高、低劑量組的細(xì)胞增殖抑制率為(70.81±1.21)%、(44.98±2.08)%，與Control組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；5-FU組的細(xì)胞增殖抑制率為(58.50±3.34)%,與Control組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 RT-PCR檢測結(jié)果

3.3.1 鑒定總RNA的完整性和純度 如圖2所示，經(jīng)凝膠電泳后，總RNA比較清晰的顯示3條條帶(28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA)。說明提取的RNA比較完整，未降解。點狀槽內(nèi)或槽附近未見熒光區(qū)帶，說明提取的RNA中DNA未被污染。應(yīng)用核酸蛋白紫外分析儀(DU-800)，檢測各組RNA樣品的質(zhì)量。得出A260、A280、A260/A280數(shù)值，進(jìn)行各組RNA樣品的濃度計算。各組RNA樣品的A260/A280都位于1.8～2.0區(qū)間內(nèi)，說明各組RNA樣品的純度良好。

表2 Dau對BxPC-3細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of Dau on the proliferation of BxPC-3 cells

與Control組比較：**P<0.01。

123428SrRNA18SrRNA5SrRNA

1. Dau高劑量組； 2. Dau低劑量組； 3. 5-FU組； 4.對照組。

圖2總RNA凝膠電泳圖
Figure2Total RNA gel electrophoretogram

3.3.2 Dau對BxPC-3細(xì)胞RafmRNA表達(dá)的影響 表3結(jié)果表明，各組與Control組比較，Dau高、低劑量組、5-FU組RafmRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 Dau對BxPC-3細(xì)胞RafmRNA表達(dá)的調(diào)控

Table1Regulation of Dau onRafmRNA expression in BxPC-3 cells

組別劑量/(μg·mL-1)△Ct△△CtRaf mRNA表達(dá)Dau高劑量組484.09±0.082.75±0.080.15±0.01?? 低劑量組242.11±0.050.77±0.050.59±0.02??5-FU組502.48±0.091.13±0.090.46±0.03??Control組-1.35±0.030.00±0.031.00±0.02

與Control組比較：**P<0.01。

3.3.3 Dau對BxPC-3細(xì)胞MEK1 mRNA表達(dá)的影響 表4所示，各組與Control組比較，Dau高、低劑量組和5-FU組MEK1 mRNA表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表4 Dau對BxPC-3細(xì)胞MEK1 mRNA表達(dá)的調(diào)控

Table4Regulation of Dau onMEK1 mRNA expression in BxPC-3 cells

組別劑量/(μg·mL-1)△Ct△△CtMEK1 mRNA表達(dá)Dau高劑量組484.53±0.493.29±0.490.11±0.04?? 低劑量組242.29±0.041.06±0.040.48±0.01??5-FU組502.40±0.261.17±0.260.45±0.08??Control組-1.23±0.42-0.00±0.421.03±0.28

與Control組比較：**P<0.01。

3.4 Western blot結(jié)果

3.4.1 Dau對BxPC-3細(xì)胞Raf蛋白表達(dá)的影響 圖3、表5結(jié)果表明，各組與Control組比較，Dau高劑量組和5-FU組Raf 蛋白表達(dá)明顯降低，具有極顯著差異(P<0.01)。Dau低劑量組蛋白表達(dá)有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

RafGAPDH74?103146?1031234

1. Dau高劑量組； 2. 5-FU組； 3. Dau低劑量組； 4.對照組。

圖3各組Raf、GAPDH蛋白的表達(dá)

Figure3Expression of Raf and GAPDH proteins in each group

表5 Dau對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞Raf蛋白表達(dá)的調(diào)控

Table5Regulation of Dau on Raf protein expression in BxPC-3 cells

組別劑量/(μg·mL-1)Raf/GAPDH(A值)Dau高劑量組480.94±0.17?? 低劑量組241.26±0.19?5-FU組501.23±0.09??Control組-1.68±0.16

與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3.4.2 Dau對BxPC-3細(xì)胞MEK1蛋白表達(dá)的影響 圖4、表6所示，與Control組比較，Dau高、低劑量組和5-FU組的MEK1 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

44?103146?103GAPDHMEK11234

1. Dau高劑量組； 2. 5-FU組； 3. Dau低劑量組； 4.對照組。

圖4各組MEK1、GAPDH蛋白的表達(dá)

Figure4Expression of Raf and GAPDH proteins in each group

表6 Dau對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞MEK1蛋白表達(dá)的調(diào)控

Table6Regulation of Dau on MEK1 protein expression in BxPC-3 cells

組別劑量/(μg·mL-1)MEK1/GAPDH(A值)Dau高劑量組480.60±0.03?? 低劑量組240.70±0.09??5-FU組500.72±0.10?? Control組-1.25±0.14

與Control組比較:**P<0.01。

4 討論

本研究以細(xì)胞劃痕方法檢測細(xì)胞遷移能力，結(jié)果表明各給藥組愈合距離明顯減小、愈合較慢，提示Dau能夠顯著降低BxPC-3細(xì)胞的遷移能力。采用PCR及Western blot技術(shù)檢測Raf和MEK1 mRNA及蛋白的表達(dá)結(jié)果表明Dau能夠明顯抑制ERK信號通路關(guān)鍵位點Raf和MEK1 mRNA及蛋白的表達(dá)。由此推斷Dau可能通過影響ERK信號通路發(fā)揮其對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的增殖和遷移作用。

ERK傳導(dǎo)通路是研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)主要信號傳遞系統(tǒng)之一[11-12]。其中惡性腫瘤細(xì)胞的遷移，都與其細(xì)胞的運動能力有關(guān)。腫瘤是在致瘤因子作用下，機(jī)體的組織細(xì)胞異常增生所形成的新生物，也稱贅生物。臨床將其分為2種：一是不轉(zhuǎn)移、生長緩慢、有包膜且邊界清楚的良性腫瘤；二是易轉(zhuǎn)移、生長迅速、侵襲生長且邊界不清的惡性腫瘤。大量文獻(xiàn)已表明，ERK通路參與調(diào)控細(xì)胞惡變，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程都與ERK通路相關(guān)[13-14]。該通路接收來自多種生長因子如PDGF、NGF等的上游信號，經(jīng)級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、AP-1的表達(dá)[15]。

有研究表明，干預(yù)ERK通路3種激酶(Raf、MEK、ERK)中的任何一個，都能阻斷通路，進(jìn)而抑制惡性腫瘤的增殖[16-17]。此通路位于信號(細(xì)胞增殖、分化及遷移)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的核心[18]，這也是作為切入點的關(guān)鍵依據(jù)之一[19]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，在促使細(xì)胞增殖、遷移、侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。若以藥物干預(yù)ERK通路上任一關(guān)鍵激酶，使其阻斷信號通路，從而抑制其通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)，就有可能對其癌細(xì)胞產(chǎn)生、增殖、轉(zhuǎn)移起到一定抑制作用，從而治療胰腺癌。

對于胰腺癌病因和ERK通路作用機(jī)制仍須進(jìn)一步深入研究，今后可以采用基因芯片技術(shù)進(jìn)一步系統(tǒng)分析Dau對BxPC-3細(xì)胞mRNA表達(dá)譜影響，開展Dau與基因的代謝通路、傳導(dǎo)通路相關(guān)性研究，以期為臨床提供有效的靶向治療新藥。