香志豪，孫冬梅，胥愛麗，畢曉黎，江潔怡，曾志浩，羅思妮

[1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州510095; 2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院(廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室),廣東 廣州 510095]

行氣溫中顆粒是廣東省第二中醫(yī)院內(nèi)部制劑，由姜厚樸、橘紅、炙甘草、草豆蔻、薏苡仁、金錢草組成，具有溫中行氣、散寒、燥濕、除滿之功效，臨床上常用治脾胃寒濕氣滯、脘腹冷痛等癥[1]。方中厚樸為君藥，功能溫中益氣、下氣除滿[2]；橘紅、草豆蔻、金錢草并為臣藥，有行氣化濕之功效[3-4]；佐以薏苡仁利水滲濕；炙甘草為使藥，可調(diào)和藥性。方中藥味，如厚樸，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其主要成分和厚樸酚與厚樸酚具有抗感染、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的作用[5]；橘紅中主要成分橙皮苷具有抗?jié)冏饔肹6]；甘草中主要成分甘草酸銨具有對胃腸道平滑肌的抑制作用[7]；草豆蔻中主要成分山姜素對胃黏膜有保護作用，可提高胃蛋白酶活性[8]。本文以行氣溫中顆粒君臣藥中的主要成分為指標性成分，采用超高效液相色譜法同時對蕓香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚6種成分進行質(zhì)量分數(shù)測定，從而可以更全面、更有效控制其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1290高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；TLE204電子分析天平(十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ700-DE數(shù)控超聲波清晰機(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-AQdevantageA10自動型純水機(德國默克公司)。

和厚樸酚對照品(批號：110730-201614，質(zhì)量分數(shù)：99.3%)、厚樸酚對照品(批號：110729-200309，質(zhì)量分數(shù)：98.8%)、甘草酸銨對照品(批號：111610-201607，質(zhì)量分數(shù)：97.7%)、橙皮苷對照品(批號：110721-201115，質(zhì)量分數(shù)：95.3%)、山姜素對照品(批號：762-9202，質(zhì)量分數(shù)：99.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院。蕓香柚皮苷對照品(批號：4-071-180917，質(zhì)量分數(shù)：99%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。行氣溫中顆粒由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供，批號分別為190701(S1)、190702(S2)、190703(S3)、190704(S4)、190705(S5)、190706(S6)、190707(S7)、190708(S8)、190709(S9)、190710(S10)、190711(S11)、190712(S12)、190713(S13)、190714(S14)、190715(S15)。

乙腈為色譜純；水為超純水；其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 行氣溫中顆粒指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters UPLC CORTECS T3C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%H3PO4水溶液(B)，梯度洗脫(0～25 min，10%A→20%A；25～40 min，20%A→35%A；40～55 min，35%A→60%A；55～65 min，60%A→70%A；65～80 min，70%A→95%A)；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量：2 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取行氣溫中顆粒約0.25 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%(體積分數(shù)，下同)甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲(700 W，50 kHz)處理30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 分別取蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、山姜素、厚樸酚、和厚樸酚對照品適量，加甲醇制成6種成分質(zhì)量濃度分別為0.239 4、0.507 0、0.171 2、0.069 5、0.214 0、0.242 8 mg/mL的對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取同一批行氣溫中顆粒(S1)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。以8號厚樸酚色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰相對峰面積及相對保留時間的RSD值均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取同一批行氣溫中顆粒(S1)，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件依次進樣測定，以8號厚樸酚色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值均小于2.5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批行氣溫中顆粒(S1)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、10、12、24 h進樣測定，以8號厚樸酚色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值均小于2.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 UPLC指紋圖譜的建立 取15批行氣溫中顆粒，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件測定。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統(tǒng)(2004 A版)”進行指紋圖譜分析，采用多點校正后進行自動匹配(時間窗為0.1 min)，提取吸收信號較強、峰形明顯、穩(wěn)定性較好的共有峰，用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，結(jié)果見圖1～2。

根據(jù)數(shù)據(jù)分析，標定了8個共有特征色譜峰，其中1、2、3、5、7、8號峰分別鑒定為蕓香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸銨、和厚樸酚、厚樸酚。15批行氣溫中顆粒樣品色譜圖與對照指紋圖譜相似度分別為0.945、0.947、0.915、0.963、0.969、0.965、0.961、0.955、0.982、0.952、0.920、0.969、0.961、0.967、0.992。15批供試品相似度均大于0.9，共有峰分離度、峰形良好。

U/mV15001200900600300010203040506070800t/minS15S14S13S12S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S1

S1～S15.S1～S15號行氣溫中顆粒； 1.蕓香柚皮苷； 2.橙皮苷； 3.山姜素； 5.甘草酸銨； 7.和厚樸酚；8.厚樸酚。

圖115批行氣溫中湯顆粒的UPLC疊加圖譜

Figure1The UPLC overlay fingerprints of 15 batches Xingqiwenzhong granules

10203040506070800t/min2101801501209060300S1(16)U/mV

1.蕓香柚皮苷； 2.橙皮苷； 3.山姜素； 5.甘草酸銨； 7.和厚樸酚；8.厚樸酚。

圖215批行氣溫中顆粒的對照圖譜

Figure2The reference fingerprint of 15 batches Xingqiwenzhong granules

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件及供試品、對照品溶液的制備 分別同“2.1.1”、“2.1.2”、“2.1.3”項下方法。

2.2.2 對照品溶液及樣品的測定 分別精密吸取各對照品、行氣溫中顆粒(S1)供試品溶液2 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖3。

2.2.3 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.1.3”項下蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、山姜素、厚樸酚、和厚樸酚對照品溶液適量，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制得6種對照品系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。各對照品質(zhì)量濃度如下：蕓香柚皮苷(0.239 4、0.191 5、0.1435、0.071 8、0.023 94 mg/mL)，橙皮苷(0.507、0.405 6、0.253 5、0.152 1、0.101 4 mg/mL)，山姜素(0.069 5、0.041 7、0.027 8、0.020 85、0.003 475 mg/mL)，甘草酸銨(0.171 2、0.128 4、0.064 2、0.042 8、0.021 4 mg/mL)，和厚樸酚(0.242 8、0.121 4、0.060 7、0.024 28、0.012 14 mg/mL)，厚樸酚(0.214、0.128 4、0.085 6、0.042 8、0.021 4 mg/mL)。分別精密吸取2 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。以對照品質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結(jié)果見表1。

12080400102030405060700t/minBACDEGF120804001208040012080400102030405060700t/minU/mVU/mVU/mVU/mV

1.蕓香柚皮苷； 2.橙皮苷； 3.山姜素； 4.甘草酸銨； 5.和厚樸酚；6.厚樸酚。A.供試品； B.蕓香柚皮苷對照品； C.橙皮苷對照品；D.山姜素對照品；E.甘草酸銨對照品；F.和厚樸酚對照品；G.厚樸酚對照品。

圖3行氣溫中顆粒(S1)、各對照品的UPLC色譜圖

Figure3The chromatograms of Xingqiwenzhong granules and reference substance

2.2.4 精密度試驗 取同一批行氣溫中顆粒(S1)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算得到蕓香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為1.34%、1.54%、1.82%、1.27%、1.77%、1.65%，表明儀器精密度良好。

表1 6種成分線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 The results of the linear relationship of the six components (n=2)

2.2.5 重復(fù)性試驗 取同一批行氣溫中顆粒供試品(S1)，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算得到蕓香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為1.93%、1.96%、1.25%、2.46%、1.58%、2.18%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批行氣溫中顆粒(S1)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件分別于0、2、4、8、10、12、24 h進樣測定，計算得到蕓香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為1.34%、1.54%、1.82%、1.77%、1.62%、1.86%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 取同一批行氣溫中顆粒(S1)6份，每份約0.125 g，精密稱定，分別置50 mL具塞錐形瓶中，加入各對照品溶液適量，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件依次測定。計算得到蕓香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚的平均加樣回收率分別為100.15%、100.24%、99.86%、98.68%、99.60%、99.98%，結(jié)果見表2。

2.2.8 樣品測定 取15批行氣溫中顆粒，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算樣品中蕓香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表3。

表2 行氣溫中顆粒中6種成分的加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 The recoveries of six components in Xingqiwenzhong granules (n=6)

表2 (續(xù))

表3 15批行氣溫中顆粒中6種成分質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果

Table3The determination results of 15 batches Xingqiwenzhong granules (n=2)w/%

批號蕓香柚皮苷 橙皮苷山姜素甘草酸銨和厚樸酚厚樸酚S10.314.410.100.290.060.28S20.653.620.230.220.250.18S30.824.710.250.270.150.22S40.134.480.090.230.130.14S50.774.360.170.280.190.21S60.293.070.120.380.110.10S70.582.530.110.320.110.15S80.333.520.130.200.080.30S90.093.510.100.220.210.28S100.154.380.120.140.080.17S110.093.880.150.200.080.16S120.563.200.140.220.100.21S130.093.860.090.180.120.21S140.593.370.130.400.090.12S150.153.690.100.260.110.15

3 討論

將行氣溫中顆粒供試品溶液于190～400 nm紫外-可見光處進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在254 nm處各色譜峰的數(shù)目、豐度、分離程度較好，最為適合指紋圖譜研究，故本研究選擇254 nm為檢測波長。在尋找最佳的色譜條件過程中，本試驗考察了不同提取方式(超聲處理、加熱回流)、不同提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、水)、不同提取時間(30、45、60 min)、不同柱溫(20、25、30 ℃)、不同流速(0.1、0.2、0.3 mL/min)、不同流動相體系(乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.2%H3PO4溶液)和不同色譜柱(Phenomenex Luna Omega Polar C18柱、Agilent Poroshell 120 EC C18柱、Waters UPLC CORTECS T3C18)的效果。通過結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)超聲與加熱回流結(jié)果并無明顯差異；50%甲醇作為提取溶劑時較其余提取溶劑提取更完全，提取液成分更豐富；提取時間分別為30、45、60 min時結(jié)果一致，無明顯差異；選擇乙腈-0.2%H3PO4溶液因為其對峰形改善好，且對峰的分離度較其余2種流動相好；Waters UPLC CORTECS T3C18柱對圖譜分離效果好，且峰形較其余色譜柱更好。綜合以上結(jié)果，最終確定了最佳提取方式及色譜條件。

本試驗建立的行氣溫中顆粒UPLC指紋圖譜，各峰分離度良好。各批次間的相對峰面積存在差異，可能于各批次間投料藥材不同有關(guān)。

本試驗建立同時測定蕓香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚6種成分的方法，對全面控制行氣溫中顆粒的質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。