江潔怡，胥愛(ài)麗，李養(yǎng)學(xué)，段福先，曾志浩，孫冬梅

(1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V東第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510405)

三白草為三白草科三白草屬植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill. 的干燥地上部分，具有清熱解毒、利水消腫的功效，臨床上主要用于水腫、小便不利、淋瀝澀痛、帶下等癥；外用可治療瘡瘍腫毒、皮膚濕疹[1]。據(jù)報(bào)道，三白草中含有揮發(fā)油[2]、黃酮[3]、木脂素[4-5]、生物堿[6]、鞣質(zhì)[7]等成分，其中木脂素、黃酮是其主要活性成分[8]，左月明[5]等從三白草中分離鑒定得到13個(gè)化合物，分別為三白脂、三白脂酮 A、1′-表-三白脂酮、里卡靈 B、里卡靈 A、5-甲氧基-里卡靈 A、三白脂素、5,5′-二甲氧基-三白脂素、nectandrin B、5,5′-dimethoxy-nectandrin B、3′,4′-methylenedioxy-3,4,5,5′-tetramethoxy-7,7′-epoxylignan、3′,4′-methylenedioxy-3,4,5-trimethoxy-7,7′-epoxylignan、machilin D 。曲瑋[9]等從三白草中分離得到7個(gè)化合物：meio-carpin、三白草內(nèi)酰胺、馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、4,5-dioxodehydroasimilobine、金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷。

本課題組前期已建立了同時(shí)測(cè)定三白草中多個(gè)木脂素類、黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法[10-11]，為了進(jìn)一步對(duì)三白草的化學(xué)組成進(jìn)行整體把握，本研究擬采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-Q-TOF-MS)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析檢測(cè)。UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)作為一種新型分析術(shù)，結(jié)合了UHPLC的高速、高分離性能和 TOF-MS的高分辨、高靈敏的定性能力以及強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)表征能力，可實(shí)現(xiàn)天然藥物中復(fù)雜龐大化合物體系的快速高效鑒定[12-14]。本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS法對(duì)三白草的化學(xué)成分進(jìn)行分析檢測(cè)，初步鑒定出了15個(gè)具有紫外吸收的化合物，為三白草質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

Exion LC 20AD超高效快速液相色譜儀，X500R QTOF高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，SCIEX OS 1.0 Software軟件，Peakview 1.2數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó) AB Sciex公司)；XS205 DU電子分析天平(美國(guó)Mettler-Toledo公司)； Micro 17R微量離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；KQ-700DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Advantage A10自動(dòng)純水機(jī)(美國(guó)MilliPore公司)。

三白草購(gòu)自廣州清平藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦教授鑒定為三白草科三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.。甲醇、乙酸銨和甲酸等液相用試劑為質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法

2.1 色譜條件

Waters XSelected T3色譜柱 (150 mm×2.1 mm,2.5 μm) ；流動(dòng)相：含2 mmol/L乙酸銨的甲酸∶甲醇(體積比0.05∶99.95)為流動(dòng)相A ，含2 mmol/L乙酸銨的甲酸∶水(體積比0.05∶99.95)為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～9 min，14%A→39%A；9～15 min，39%A→40%A；15～17 min，40%A→52%A；17～36 min，52%A→80%A；36～39 min，80%A→95%A；39～42 min，95%A；42～42.1 min，95%A→14%A；42.1～45 min，14%A)；柱溫：35 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI離子源，正離子掃描模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；氣簾氣壓力0.21 MPa，霧化氣壓力0.34 MPa，輔助氣壓力0.34 MPa，毛細(xì)管電壓5.5 kV，離子源溫度400 ℃，去簇電壓80 V，碰撞電壓(40±20)V。

2.3 供試品溶液的制備

取三白草粉末(過(guò)4號(hào)篩)約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇50 mL，超聲處理30 min，放冷，搖勻，于13 000 r/min下離心10 min，取上清液，即得。

3 結(jié)果

3.1 UHPLC-Q-TOF-MS成分鑒定

按照擬定的條件進(jìn)行分析，得到三白草樣品的紫外吸收色譜圖及正離子模式下的總離子流圖，見(jiàn)圖1。從總離子流圖上得到各色譜峰的精確化合物分子量信息，并根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量與理論精確相對(duì)分子質(zhì)量的偏差小于百萬(wàn)分之五內(nèi)計(jì)算其精確分子式。運(yùn)用Peakview數(shù)據(jù)處理軟件，與建立的三白草已知化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)、ChemSpider 等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，根據(jù)各化合物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜，同位素分布及化合物裂解規(guī)律做對(duì)比推測(cè)。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果，共鑒定了三白草中15種具有紫外吸收的化學(xué)成分，見(jiàn)表1。

t/min3002001000-100150010005000mAU051015202530354045BAAU123456789101112131415

A. 正離子模式； B. 紫外吸收。

圖1三白草樣品總離子流圖
Figure1Total ion chromatograms of Saururi Herba

3.2 色譜峰的質(zhì)譜裂解規(guī)律

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，共鑒定了三白草中15種化學(xué)成分：綠原酸[15]、1-(7H-purin-6-yl)-4-piperidine carboxamide[16]、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷[17]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷[18]、金絲桃苷[18-19]、蘆丁[18-19]、槲皮素-3-鼠李糖苷-7-葡萄糖苷[18]、槲皮苷(槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷)[18-19]、紅楠素 D[19]、Gelomulide N[20]、三白草酮[19]、(-)-二氫愈創(chuàng)木脂酸[19,22-23]、里卡靈 A[19,24]、12-phenyldodecanoic acid[21]、馬納薩亭 B[19]、5-(2,5-dimethyl-benzyloxy)-2-methyl-benzofuran-3-carboxylic acid methyl ester[19]。以綠原酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、(-)-二氫愈創(chuàng)木脂酸、里卡靈 A的鑒定過(guò)程為代表進(jìn)行詳細(xì)分析如下。

綠原酸：正離子模式下，得到分子離子峰355.101 4 [M+H]+，通過(guò)軟件計(jì)算得到分子式為C16H18O9。二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子m/z163.0386可能是母離子水解失去奎寧酸后的咖啡酸碎片離子峰，另有碎片離子m/z135.043 6 [M+H-C7H11O6-CO]+，如圖2所示。符合咖啡奎尼酸類化合物裂解途徑，結(jié)合文獻(xiàn)[14]，推斷峰1為綠原酸。

槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷：正離子模式下，得到分子離子峰479.082 1 [M+H]+，通過(guò)軟件計(jì)算得到分子式為C21H18O13。二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生碎片離子m/z303.049 8可能是母離子水解失去葡萄糖醛酸后的槲皮素苷元碎片離子峰，另有碎片離子m/z285.041 9[M+H-C6H8O6-H2O]+，m/z257.044 8 [M+H-C6H8O6-H2O-CO]+，m/z229.049 2 [M+H-C6H8O6-H2O-CO-CO]+，如圖3所示。符合黃酮苷類化合物裂解途徑，結(jié)合文獻(xiàn)[16]，推斷峰3為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。

表1 三白草的 UHPLC- Q-TOF-MS 鑒定結(jié)果Table 1 Chemical constituents of Saururi Herba by UHPLC-Q-TOF-MS

圖2 綠原酸的裂解途徑Figure 2 Fragmentation pathway of chlorogenic acid

圖3槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的裂解途徑
Figure3Fragmentation pathway of quercetin 3-O-β-D-glucuronide

(-)-二氫愈創(chuàng)木脂酸：正離子模式下，得到分子離子峰331.190 1 [M+H]+，通過(guò)軟件計(jì)算得到分子式為C20H26O4。二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生碎片離子m/z207.137 9 [M+H-C20H17O2]+，m/z137.059 2 [M+H-C7H7O2]+，如圖4所示。符合木脂素類化合物裂解途徑，結(jié)合文獻(xiàn)[21-22]，推斷峰11為(-)-二氫愈創(chuàng)木脂酸。

里卡靈 A：正離子模式下，得到分子離子峰327.158 8 [M+H]+，通過(guò)軟件計(jì)算得到分子式為C20H22O4。二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生碎片離子m/z203.105 7 [M+H-C7H7O2]+，m/z188.082 6 [M+H- C7H7O2-CH3]+，m/z173.059 7 [M+H-C7H7O2-CH2O]+，m/z145.064 6 [M+H-C7H7O2-CH2O-CO]+，m/z137.059 4 [M+H-C12H13O2]+，如圖5所示。結(jié)合文獻(xiàn)[23]，推斷峰12為里卡靈 A。

圖4(-)-二氫愈創(chuàng)木脂酸的裂解途徑

Figure4Fragmentation pathway of (-)-dihydroguaiaretic acid

圖5里卡靈 A的裂解途徑
Figure5Fragmentation pathway of licarin A

4 討論

實(shí)驗(yàn)考察了純甲醇、80%甲醇、50%甲醇、水為提取溶劑時(shí)對(duì)三白草中成分的提取效果的影響，結(jié)果當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)低于50%時(shí)，木脂素類成分的提取效率較低，而當(dāng)用純甲醇為溶劑時(shí)，黃酮類成分的提取率低于80%甲醇。故為最大效率地對(duì)全成分進(jìn)行提取，選取80%甲醇作為提取溶劑；另對(duì)提取方式的考察發(fā)現(xiàn)，超聲提取與回流提取效果差異不大，為操作簡(jiǎn)便，故選擇超聲提取。

在摸索色譜條件索時(shí)，確定了以甲醇-0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)H3PO4為流動(dòng)相。但考慮到TOF/MS對(duì)不揮發(fā)性鹽的限制，擬把H3PO4改為甲酸。另由于檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，接近甲酸的末端吸收，梯度后半部分色譜圖會(huì)出現(xiàn)塌陷，故在流動(dòng)相A、B中均加入0.05%甲酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分成分信號(hào)較弱。為了進(jìn)一步增強(qiáng)化合物的電離，提高檢測(cè)靈敏度，最終把流動(dòng)相改為含2 mmol/L乙酸銨的甲酸∶甲醇(體積比0.05∶99.95)與含2 mmol/L乙酸銨的甲酸∶水(體積比0.05∶99.95)，結(jié)果色譜峰分離度高且質(zhì)譜信號(hào)較強(qiáng)。

木脂素類化合物是三白草中最主要的化學(xué)組成成分，也是發(fā)揮藥效作用的主要成分[7,25]，而黃酮類成分作為三白草中另一種主要化學(xué)成分，同樣具有重要的生理活性[25-26]。本實(shí)驗(yàn)采用 UHPLC-Q-TOF-MS法快速分析三白草中的化學(xué)成分，鑒定了15個(gè)具有紫外吸收的化合物，其中2個(gè)有機(jī)酸類化合物、1個(gè)萜類化合物、1個(gè)生物堿類化合物、5個(gè)黃酮類化合物、7個(gè)木脂素類化合物，為三白草的質(zhì)量控制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為三白草藥材資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、利用奠定理論基礎(chǔ)。而對(duì)于未鑒定出的化合物，還有待以后深入研究。