張慶，袁源，鄧揚(yáng)龍，周翔宇，樊桂靈，李玉鋒

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)

在當(dāng)今許多經(jīng)濟(jì)型干果樹(shù)中，核桃具有良好持久的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。核桃油生產(chǎn)占據(jù)了核桃加工產(chǎn)業(yè)的主要地位，但榨油后殘余的核桃蛋白質(zhì)利用率極低。在現(xiàn)有研究中指出，核桃仁含有豐富的核桃蛋白、脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素，具有延緩衰老、降低冠心病發(fā)病率、健腦益智、抑制炎癥等作用。對(duì)核桃仁的營(yíng)養(yǎng)分析得出，核桃仁含有約65%的油和18%～24%的蛋白質(zhì)[1-2]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，核桃蛋白的蛋白質(zhì)含量非常豐富，共有18種不同的氨基酸，其中谷氨酸含量最高，精氨酸次之[1]。而通過(guò)蛋白質(zhì)水解得到的活性肽具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易吸收、無(wú)抗原性、避免耐藥、經(jīng)消化道進(jìn)入人體后無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)。迄今，蛋白質(zhì)水解后的多肽在功能特性與生物活性上都略勝一籌。例如溶解性、乳化性和起泡性都隨著適宜水解逐漸增加。所以，各國(guó)科學(xué)家和政府對(duì)生物活性肽的研究也越來(lái)越重視[3]，國(guó)內(nèi)外對(duì)生物活性肽的研究發(fā)展進(jìn)一步提升。

蛋白質(zhì)的水解方式主要包括化學(xué)降解和酶法降解[4]。從100多年前就有學(xué)者提出化學(xué)降解這類(lèi)研究辦法，而化學(xué)法分為酸降解與堿降解，但酸堿反應(yīng)條件較為劇烈。酸水解可破壞其中色氨酸，堿水解則使胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸等受到損傷，還會(huì)引起氨基酸的外消旋化[5]。由此，酶法水解與化學(xué)法相比，具有效率高、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。在水解過(guò)程中，氨基酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型保持不變，只破壞肽鍵，不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)[6-7]。因此，采用酶解方法受到越來(lái)越多學(xué)者的青睞。

蛋白質(zhì)水解度(degree of hydrolysis,DH)表示蛋白質(zhì)分解即肽鍵斷裂的程度，是破壞的肽鍵數(shù)目與底物中肽鍵總數(shù)的百分比[8]。蛋白質(zhì)在水解過(guò)程中會(huì)酶解成多肽以及氨基酸，適度水解可保證多肽得率效果極佳，而過(guò)度水解則會(huì)增加氨基酸的生成量，可根據(jù)在水解過(guò)程中加入的NaOH量來(lái)計(jì)算，以保持水解過(guò)程中的pH恒定[9]。多肽含量測(cè)定針對(duì)蛋白質(zhì)水解后溶液中多肽的生成量，常規(guī)測(cè)定方法主要有凱氏定氮法(Kjeldahl determination, KD)[10]、考馬斯亮藍(lán)(Bradford) 染色法[11]、雙縮脲比色法(biuret assay, BA)[12]、Folin-酚試劑法(Lowry)[13]、紫外分光光度法(ultraviolet-spectrophotometric, UV-S)[14]。本研究采用雙縮脲比色法進(jìn)行測(cè)定。

響應(yīng)面法(response surface method，RSM)將試驗(yàn)的目標(biāo)響應(yīng)值(如核桃多肽提取率)作為單個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)因素(如酶解時(shí)間、酶解溫度等)的目標(biāo)函數(shù)，然后將上述函數(shù)關(guān)系通過(guò)多維圖形進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)圖形分析、函數(shù)求導(dǎo)等方式優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最佳條件[15]。響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最大優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)更少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和更佳的實(shí)驗(yàn)組合接近最優(yōu)值。即采用響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核桃，四川省巴中市。

1.2 主要試劑

丁烷、NaOH、HCl、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶，上海瑞永生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

BT-423S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；CBE-10L亞臨界流體萃取設(shè)備，河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司；SHA-B振蕩水浴鍋，常州市金壇華偉儀器廠；101真空冷凍干燥機(jī)，上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；PHS-2C pH計(jì)，上海雷磁儀器公司；D-37520型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；UV-1600型紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；ZN-200A高速中藥粉碎機(jī)，長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；移液槍?zhuān)惸w世爾科技(中國(guó))有限公司；HWS24恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 核桃蛋白的制備

將核桃干燥后粉碎，采用亞臨界丁烷萃取核桃油，重復(fù)3次，直至核桃油完全萃出，得到脫脂核桃粕。于4 ℃下低溫冷藏備用。

將烘干的核桃脫脂粉按一定的的料液比分散在蒸餾水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的核桃蛋白溶液。混合物用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 8.5，55 ℃水浴攪拌2 h，8 000 r/min低溫離心20 min，棄去沉淀，保留上清液，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 4.5，攪拌1 h，8 000 r/min低溫離心20 min，沉淀用蒸餾水水洗至中性，調(diào)節(jié)pH至中性后,冷凍干燥24 h并儲(chǔ)存在干燥器內(nèi)備用。

2.2 核桃蛋白酶解液制備及預(yù)處理

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[16-18],按照各蛋白酶的最佳底物濃度稱取一定量的核桃蛋白,加蒸餾水配制成相應(yīng)濃度的蛋白溶液，于水浴鍋中一定溫度和時(shí)間預(yù)處理后，調(diào)至最適pH，加入一定量各蛋白酶，于各蛋白酶最適水解溫度下反應(yīng)一段時(shí)間，期間用1.0 mol/L的NaOH維持pH，酶解結(jié)束后放置于90 ℃水浴鍋 10 min滅活終止反應(yīng)，8 000 r/min低溫離心20 min，保留上清液，測(cè)定水解度和多肽含量。

將上述試驗(yàn)方法作為基礎(chǔ)，略作修改，得到木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶的最佳酶解條件如表1所示(%均表示為體積分?jǐn)?shù))：

表1 每種蛋白酶的最佳酶解條件Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of eachprotease

2.3 水解度的測(cè)定

采用pH-stat法測(cè)定核桃蛋白質(zhì)的水解度，以滴定核桃蛋白所消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積計(jì)算水解度[19]，如公式(1)所示。

(1)

式中:DH,水解度；B,最適pH時(shí)所消耗NaOH的體積，mL；Nb,標(biāo)準(zhǔn)NaOH濃度，mol/L；Mp,加入水解蛋白質(zhì)含量，g；htot,蛋白質(zhì)中肽鍵的總數(shù)，mmol/g蛋白，本文核桃蛋白的htot為8.0 mmol/g；α,水解過(guò)程中核桃蛋白中的α-氨基的解離度，計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：PK,水解過(guò)程中釋放的氨基的平均離解值，取決于溫度、肽鏈長(zhǎng)度和末端氨基酸的性質(zhì)。

2.4 多肽含量的測(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

依照相關(guān)試驗(yàn)方法[20-21]，略作修改后測(cè)定蛋白水解液中多肽含量。準(zhǔn)確量取體積分?jǐn)?shù)5% TCA配制的0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支10 mL容量瓶中，加水補(bǔ)至刻度線，取上述溶液各6 mL，然后加入雙縮脲試劑4 mL，充分振蕩搖勻后，室溫孵育0.5 h，3 000 r/min離心5 min，于540 nm處測(cè)定吸光值。用第1支空白蛋白質(zhì)溶液作為對(duì)照液。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確量取樣品溶液2.5 mL，加入相同量的10% TCA水溶液，充分振蕩均勻，室溫孵育10 min，然后在3 000 r/min下離心15 min，將上清液用5% TCA水溶液定容至50 mL容量瓶中，充分振蕩搖勻，后續(xù)操作按2.4.1進(jìn)行，結(jié)果對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的多肽含量(mg/mL)。

2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素分別選取酶解時(shí)間、酶解溫度、酶濃度以及酶解pH，考察各因素對(duì)蛋白質(zhì)水解度以及多肽含量的影響，確定堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳工藝。

2.5.1 酶解時(shí)間的影響

在酶解溫度為50 ℃時(shí)，底物濃度為2%，酶解pH為7的條件下，探究酶解時(shí)間為2、3、4、5、6、7 h對(duì)蛋白質(zhì)水解度以及多肽含量的影響。

2.5.2 酶解溫度的影響

在酶解時(shí)間為5 h，底物濃度為2%，酶解pH為7的條件下，探究酶解溫度為40、45、50、55、60、65 ℃對(duì)蛋白質(zhì)水解度以及多肽含量的影響。

2.5.3 加酶量的影響

在酶解時(shí)間為5 h，酶解溫度為50 ℃，酶解pH為7的條件下，探究加酶量為1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%對(duì)蛋白質(zhì)水解度以及多肽含量的影響。

2.5.4 酶解pH的影響

在酶解時(shí)間為5 h，酶解溫度為50 ℃，底物濃度為2%的條件下，探究酶解pH為4、5、6、7、8、9對(duì)蛋白質(zhì)水解度以及多肽含量的影響。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝

在單因素試驗(yàn)中，酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度以及酶解pH對(duì)多肽含量以及水解度影響較大，因此以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為根據(jù)，選取這4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以多肽含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平，優(yōu)化堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的工藝條件，每組試驗(yàn)平行3次。按照Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理確定最佳提取條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素水平編碼見(jiàn)表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Table 2 Response surface test factor level coding table

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 9.0軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，采用Origin 9.1軟件進(jìn)行線性回歸分析及作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 預(yù)處理測(cè)定結(jié)果

3.1.1 多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(mg/mL)，其吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖1所示。線性回歸方程為y=0.379 7x+0.017 4，相關(guān)系數(shù)R2為0.997 1，說(shuō)明多肽質(zhì)量濃度在0.02～1.6 mg/mL范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gly-Tyr-Arg tetrapeptide standard curve

3.1.2 各蛋白酶水解度、多肽含量對(duì)比

木瓜蛋白酶歸于巰基蛋白酶，它水解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基末端，優(yōu)先水解肽鍵與肽鍵N端有2個(gè)羧基的氨基酸或芳香族L-氨基酸。根據(jù)圖2、圖3可知，堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解度分別為19.56%、11.70%和9.24%，多肽含量為2.210、1.936、1.812 mg/mL。在各蛋白酶的最佳作用條件下對(duì)比上述結(jié)果可知，堿性蛋白酶在水解度和多肽含量方面都略勝一籌，故選擇其作為工藝優(yōu)化的原料酶。

圖2 各蛋白酶酶解核桃多肽水解度比較Fig.2 Comparison of hydrolysis degree of walnut peptideshydrolyzed by proteases

圖3 各蛋白酶酶解核桃多肽含量比較Fig. 3 Comparison of the contents of walnut peptideshydrolyzed by proteases

3.2 酶法提取核桃多肽含量單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 加酶量對(duì)酶解反應(yīng)的影響

將不同梯度堿性蛋白酶進(jìn)行測(cè)定，得到不同加酶量條件下多肽質(zhì)量濃度對(duì)比如圖4所示。

圖4 加酶量對(duì)多肽濃度的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on polypeptideconcentration

由圖4可知，堿性蛋白酶加酶量在1%～3.5%之間，隨著加酶量的增加，核桃多肽含量增加，之后再增加酶量，其多肽含量逐漸降低。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因可能是在核桃蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中，隨著加酶量的增加，過(guò)多的酶分子抑制了中間產(chǎn)物向酶解反應(yīng)終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。蛋白酶在一定范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，酶與底物相互結(jié)合反應(yīng)的能力隨之加大，酶促反應(yīng)速度迅速增加，多肽含量也隨之快速增加。當(dāng)酶量達(dá)到飽和后，過(guò)量的酶抑制酶解反應(yīng)。以上現(xiàn)象說(shuō)明不同的作用底物，其蛋白酶的最適添加量不同，人們一般選用酶最佳反應(yīng)條件時(shí)，酶的利用率最高。

3.2.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

將堿性蛋白酶不同酶解時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，得到不同酶解時(shí)間條件下多肽質(zhì)量濃度對(duì)比如圖5所示。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)多肽質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on polypeptideconcentration

由圖5可以看出，適當(dāng)?shù)拿附鈺r(shí)間有助于提高多肽質(zhì)量濃度。在酶解時(shí)間2～4 h內(nèi)，核桃多肽質(zhì)量濃度隨著時(shí)間增加而迅速上升，4 h之后，隨著時(shí)間增加質(zhì)量濃度反而呈下降的趨勢(shì)。出現(xiàn)以上結(jié)果的原因可能是在較短時(shí)間內(nèi)，底物與酶的接觸反應(yīng)時(shí)間較短，接觸面積不夠完全，整個(gè)溶液體系的流動(dòng)性較小，限制了酶發(fā)揮作用，造成多肽并沒(méi)有被充分酶解出來(lái)，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)之后，底物與酶接觸過(guò)大，溶液呈現(xiàn)過(guò)于飽和狀態(tài)，酶解過(guò)度成為了寡肽。所以，選擇pH 4作為最佳條件。

3.2.3 酶解pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響

將堿性蛋白酶按不同酶解pH進(jìn)行測(cè)定，得到不同酶解pH條件下多肽質(zhì)量濃度對(duì)比如圖6所示。

圖6 酶解pH對(duì)多肽濃度的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis of pH on peptideconcentration

根據(jù)圖6的曲線走勢(shì)可以看出，多肽濃度對(duì)于酶解pH是比較敏感的，多肽濃度最高的點(diǎn)位在pH 7。多肽濃度隨著pH變化而變化，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，pH較高會(huì)使酶失活。酶自身的活性基團(tuán)受酸堿值影響，pH的升降都會(huì)對(duì)其活性部位在酶解反應(yīng)中產(chǎn)生的作用做出相應(yīng)的改變。所以，綜上，選擇pH為7作為本實(shí)驗(yàn)最佳條件。

3.2.4 酶解溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

將堿性蛋白酶按不同酶解溫度進(jìn)行測(cè)定，得到不同酶解溫度條件下多肽質(zhì)量濃度對(duì)比如圖7所示。

圖7 酶解溫度對(duì)多肽濃度的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis temperature onpeptide concentration

當(dāng)試驗(yàn)酶解溫度從40 ℃開(kāi)始逐漸增加時(shí)，溶液中多肽質(zhì)量濃度也隨之增加，在50 ℃～60 ℃之間，多肽的質(zhì)量濃度無(wú)顯著變化,但在55 ℃時(shí)多肽達(dá)到最高質(zhì)量濃度。不同的酶作用的最適溫度不同，過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)降低酶解反應(yīng)的效率，經(jīng)試驗(yàn)，選擇55 ℃作為最適溫度。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化核桃多肽工藝

根據(jù)上述各單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，選取四川薄皮核桃蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，確定Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平。以加酶量(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)、酶解pH(D)為自變量，以反應(yīng)過(guò)后所得多肽濃度為目標(biāo)函數(shù)值，建立對(duì)應(yīng)函數(shù)關(guān)系。采用Design-Expert 10統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，回歸方程的方差顯著性檢驗(yàn)分析結(jié)果見(jiàn)表3，響應(yīng)面模型的方差分析見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)組合及結(jié)果Table 3 Response surface experiment combination andresults

由表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到表4的方差分析表，并得到擬合方程

Y=2.42+0.054A+0.012B+4×10-3C-0.022D-0.035AB+0.040AC+0.016AD-5.5×10-3BC-2.5×10-3BD-0.018CD-0.076A2-0.025B2-0.059C2-0.051D2

表4 響應(yīng)面模型的方差分析表Table 4 Variance analysis table of response surface model

注：*表示P值≤0.05，差異顯著；*表示P值≤0.01，差異極顯著。

上述擬合方程的R2=0.906 8,且該模型顯著值>0.000 1，線性關(guān)系表現(xiàn)優(yōu)良。由表4可知，一次項(xiàng)堿性蛋白酶加酶量影響極顯著，酶解pH影響顯著，而酶解時(shí)間和酶解溫度差異不顯著；二次項(xiàng)堿性蛋白酶加酶量、酶解溫度、酶解pH都是差異極顯著的、酶解時(shí)間差異顯著；在實(shí)驗(yàn)的交互影響當(dāng)中，堿性蛋白酶加酶量和酶解時(shí)間、加酶量和酶解溫度交互作用顯著；加酶量和酶解pH、酶解時(shí)間和酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解pH、酶解溫度和酶解pH交互作用差異不顯著。

圖8～圖13為雙因素交互作用曲面圖和等高線圖，根據(jù)等高線的位點(diǎn)不同可判斷交互作用是否顯著，等高線呈橢圓形則說(shuō)明交互作用顯著，并隨著橢圓長(zhǎng)半軸變長(zhǎng)交互越顯著，而圓形則表示交互不顯著。從圖8可以得到，堿性蛋白酶加酶量和酶解時(shí)間對(duì)提取多肽質(zhì)量濃度影響交互作用顯著，隨著加酶量和酶解時(shí)間的增加，提取多肽濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。這是在反應(yīng)達(dá)到飽和后加入過(guò)量的酶不能增加多肽質(zhì)量濃度，而過(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間反而會(huì)影響反應(yīng)中接觸面積從而降低多肽質(zhì)量濃度。從圖9可知，堿性蛋白酶加酶量和酶解溫度交互作用對(duì)提取多肽質(zhì)量濃度影響極顯著，當(dāng)加酶量過(guò)大和酶解溫度過(guò)高后，提取多肽質(zhì)量濃度反而減小，這是因?yàn)槊附鉁囟冗^(guò)大易使酶失活。

圖8 堿性蛋白酶加酶量和酶解時(shí)間對(duì)提取多肽濃度的影響Fig.8 Effect of alkaline protease addition enzyme andenzymatic hydrolysis time on extracted peptideconcentration

圖9 堿性蛋白酶加酶量和酶解溫度對(duì)提取多肽濃度的影響Fig.9 Effect of alkaline protease addition enzyme andenzymatic hydrolysis temperature on extracted peptideconcentration

圖10 堿性蛋白酶加酶量和酶解pH對(duì)提取多肽濃度的影響Fig.10 Effect of alkaline protease addition enzyme andenzymatic hydrolysis pH on extracted peptide concentration

圖11 酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)提取多肽濃度的影響Fig.11 Effect of enzymatic hydrolysis time and enzymatichydrolysis temperature on the concentration of extractedPeptide

圖12 酶解時(shí)間和酶解pH對(duì)提取多肽濃度的影響Fig.12 Effects of enzymatic hydrolysis time and enzymatichydrolysis pH on the concentration of peptides extracted

圖13 酶解溫度和酶解pH對(duì)提取多肽濃度的影響Fig.13 Effects of enzymatic hydrolysis temperature andenzymatic hydrolysis pH on the concentration of extractedpeptides

從圖10可知，加酶量和酶解pH交互作用極顯著，隨著加酶量和酶解pH的增加，提取多肽質(zhì)量濃度先上升后略下降，加酶量升到一定值后對(duì)提取值的影響變化較小，因?yàn)榧用噶亢兔附鈖H過(guò)高也易導(dǎo)致堿性蛋白酶酶活性降低甚至失活。

從圖11可知，酶解時(shí)間和酶解溫度的交互作用極顯著，響應(yīng)曲面反應(yīng)的趨勢(shì)先上升后略下降，剛開(kāi)始時(shí)反應(yīng)不完全且酶解溫度低，提取不完全，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能導(dǎo)致多肽濃度飽和甚至是酶解過(guò)度。從圖12可知，酶解時(shí)間與酶解pH的交互作用顯著，等高線圖表明適宜酶解時(shí)間條件下，更高一些的酶解pH有利于多肽的提取。從圖13可知，酶解溫度與酶解pH的交互作用顯著，曲線與等高線表明酶解溫度適宜時(shí)，過(guò)高pH會(huì)使酶失活，導(dǎo)致酶解不適當(dāng)，多肽濃度較低。

綜合分析得到酶解法提取多肽濃度的最佳條件為加酶量2.03%，酶解時(shí)間4.2 h，酶解溫度50.24 ℃，酶解pH 7.13,根據(jù)實(shí)際情況可將最佳工藝條件調(diào)整為加酶量2%，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度50 ℃，酶解pH 7，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證得到核桃多肽提取質(zhì)量濃度為2.55 mg/mL，與上述預(yù)測(cè)結(jié)果無(wú)偏差，說(shuō)明預(yù)測(cè)結(jié)果良好。