曹偉華，羅娜，孫義玄，涂京霞，劉靜，王德良，郝建秦，欒春光*，包怡紅

1(東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱，150040) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)3(廣州南沙珠江啤酒有限公司，廣東 廣州，511462)

啤酒是世界上最受歡迎的酒精飲料之一。盡管工業(yè)生產(chǎn)中對微生物污染高度重視，但由于啤酒微生物的高度適應性，微生物污染的情況仍時有發(fā)生，這給啤酒生產(chǎn)企業(yè)帶來了極大的困擾[1]。

啤酒中的腐敗菌種類較多，以乳酸菌為主。近年，啤酒中發(fā)現(xiàn)的1個新啤酒腐敗菌菌種——耐乙酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)，因其特殊的生理特性引起了人們的關注[2]。啤酒中的耐乙酸乳桿菌保持了乳桿菌的菌種特性，以乳酸、醋酸和雙乙酰為糖酵解終產(chǎn)物，大量的雙乙酰使啤酒產(chǎn)生了令消費者不愉快的黃油味和油膩的口感，嚴重影響了啤酒的品質；同時，該菌具有在一般營養(yǎng)條件下不易培養(yǎng)的生理特性，國標等常規(guī)方法難以檢測到此菌，出現(xiàn)假陰性結果[3]。這使得啤酒在貯存或銷售環(huán)節(jié)易出現(xiàn)質量問題，嚴重影響產(chǎn)品形象和企業(yè)聲譽。

基于微生物檢測技術的快速發(fā)展，除常規(guī)的檢測方法外，蛋白質和核酸等分子檢測手段也得到廣泛應用。其中聚合酶鏈式反應(polmerase chain reaction, PCR)技術以其較高的靈敏性和準確性在啤酒腐敗菌檢測中得到普遍認可[4]。PCR檢測多以啤酒腐敗菌某些特定的靶標進行檢測，包括16SrDNA通用引物和四聯(lián)球菌特異性引物等[5-7]；或利用某些特殊抗性基因，如酒花抗性基因horA[8]、horB[9]或horC[10-11]進行跨種屬檢測，以實現(xiàn)對啤酒腐敗菌的快速檢測。但對于新出現(xiàn)的啤酒污染菌仍然需要建立對應的檢測方法，以實現(xiàn)對其進行有效的監(jiān)控[12]。因此本研究以建立啤酒中耐乙酸乳桿菌種特異性檢測體系為切入點，建立特異性的檢測體系，以實現(xiàn)對啤酒生產(chǎn)過程質量檢測和對出廠啤酒提供必要的技術保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

2-16N高速微量離心機，湖南恒諾儀器設備有限公司；NanoDrop One，賽默飛世爾儀器有限公司；ABI7500 real time PCR system，美國ABI公司；Multiskan FC酶標儀，賽默飛世爾儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；BX51顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；LRH-250培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；BC-C57PCR儀，北京天林恒泰科技有限公司；BG-sub MIDI多用途水平電泳儀、Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

NBB-P培養(yǎng)基，德樂公司；KK4601 KAPA SYBR FAST試劑盒，KAPA BIOSYSTEMS；細菌基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.2 本研究中使用的菌株

本研究中使用的菌株均分離自出現(xiàn)混濁、異味或產(chǎn)生沉淀的啤酒樣品，共分離鑒定了12株啤酒腐敗菌，菌株信息見表1。所有菌株均采用平板分離后再進行厭氧培養(yǎng)[13-14]。

表1 本研究中分離和使用的啤酒腐敗菌菌株Table 1 Beer spoilage strains isolated and used in the study

1.3 引物設計與驗證

1.3.1 耐乙酸乳桿菌特異性基因的篩選與引物設計

目前開放的GenBank數(shù)據(jù)庫中僅有一株較為完整的耐乙酸乳桿菌的基因組數(shù)據(jù)，其余均為基因組草圖[15-16]。研究中根據(jù)以上數(shù)據(jù)和預測的蛋白質信息，利用Mauve軟件比對GenBank中23株耐乙酸乳桿菌基因組，從中篩選出10個耐乙酸乳桿菌較為特異的基因編碼區(qū)片段，然后將基因編碼序列與數(shù)據(jù)庫中的微生物序列進行BLAST比對，在比對結果中排除具有較多相似菌株且相似度較高的基因序列，保留比對結果中只有耐乙酸乳桿菌的特異性基因序列，以此篩選出耐乙酸乳桿菌特有的基因作為檢測的備選基因用于后續(xù)研究。

1.3.2 引物設計

下載篩選到的目的基因序列，使用Primer premier 5軟件進行引物設計。引物長度18～24 bp，GC含量40%～60%，目標產(chǎn)物在130 bp～300 bp，Tm值在55～60℃，設計完成后登錄在線引物設計工具[17-18]，在模板輸入框中分別輸入引物上下游序列，在線檢測合成產(chǎn)物。

1.4 擴增體系與反應條件

將設計好的引物送上海生工生物有限公司合成。擴增反應總體系為20 μL，包括上下游引物各0.4 μL(200 nmol/L)，基因組DNA為1.0 μL(1 ng/μL)，2×mix10 μL，50×ROX 0.4 μL，無菌水定容到20 μL；反應條件見表2。

1.5 耐乙酸乳桿菌定性檢測

1.5.1 引物特異性驗證

表2 耐乙酸乳桿菌種特異性PCR反應條件Table 2 Speceis-specific PCR reaction conditions

以提取的啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌基因組DNA為模板，使用設計的10對耐乙酸乳桿菌引物分別對每種菌的基因組進行擴增，篩選特異性最佳的耐乙酸乳桿菌引物用于后續(xù)混合菌中耐乙酸乳桿菌的定性和定量檢測[19-20]。

1.5.2 混合菌中耐乙酸乳桿菌的定性檢測

以本研究中使用的12株啤酒腐敗菌的基因組DNA混合物作為模板，檢測篩選的特異性引物在混合菌中耐乙酸乳桿菌的檢出情況[21]。

1.5.3 同種屬耐乙酸乳桿菌的檢測

以同種屬的耐乙酸乳桿菌2011-3(2011年3月在8°純生啤酒中回收樣品中檢出)與2011-8(2011年8月在10°純生微檢留樣中檢出)的DNA為模板，檢測引物特異性。

1.6 耐乙酸乳桿菌特異性探針的定量檢測

使用細菌基因組提取試劑盒，提取耐乙酸乳桿菌的菌懸液(1.0×108CFU/mL)基因組。經(jīng)10倍系列梯度稀釋，得到耐乙酸乳桿菌不同DNA濃度的標準品。再以該標準品為模板，使用篩選到的特異性耐乙酸乳桿菌引物進行RT-qPCR擴增，建立耐乙酸乳桿菌的標準曲線，得到標準曲線的相關性方程，用于后續(xù)的實際樣品檢測[22]。

1.7 耐乙酸乳桿菌特異性探針的最低檢出限

將培養(yǎng)好的耐乙酸乳桿菌按照10倍系列梯度稀釋后，分別接種到NBB-B液體培養(yǎng)基中，26 ℃厭氧培養(yǎng)2 d，提取基因組。利用優(yōu)化的種特異性引物對目標菌上機檢測，比對確認樣品中耐乙酸乳桿菌的菌量與實際值之間的差異，完成樣品中耐乙酸乳桿菌的種特異性定性和定量檢測。

1.8 耐乙酸乳桿菌特異性引物檢測實際樣品

跟蹤生產(chǎn)上的20批樣品，利用膜過濾(0.45 μm)富集啤酒樣品中的微生物。然后，將抽濾膜置于NBB-B培養(yǎng)基中，26 ℃厭氧培養(yǎng)2 d，取10 mL菌液提取基因組DNA，然后使用本研究方法進行檢測。同時，對陽性樣品進行菌株分離，然后送往華大基因公司進行測序，對比本研究建立的方法與實際樣品的一致性。

2 結果與分析

2.1 特異性引物篩選和定性檢測

2.1.1 耐乙酸特異性引物的篩選

按照1.3的方法，初步篩選10個基因作為備選靶標用于啤酒中耐乙酸乳桿菌的種特異性檢測。以啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌CN247基因組DNA為模板，經(jīng)RT-qPCR擴增后，剔除產(chǎn)生非特異性片段的引物，最終確定了3對特異性強的引物，引物序列如表3所示。

表3 本研究篩選的啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌的特異性引物序列Table 3 Specific primer sequence for Lactobacillus acetotolerans

2.1.2 耐乙酸乳桿菌特異性引物定性檢測單一DNA模板的結果

以本研究中12株菌的基因組為模板，分別用YW5、YW6和YW7三對耐乙酸乳桿菌特異性引物進行RT-qPCR擴增，以確認3對引物對耐乙酸乳桿菌檢測的特異性。YW5、YW6和YW7特異性引物的RT-qPCR擴增曲線和熔解曲線如圖1所示。

圖1 YW5、YW6和YW7引物在RT-qPCR上檢測單一DNA的擴增曲線和熔解曲線Fig.1 Amplification curve and melting curve of detection of single DNA by YW5,YW6 and YW7 primers on RT-qPCR

如圖1所示，使用1.4的反應體系和反應條件，YW5、YW6和YW7三對引物只有在擴增耐乙酸乳桿菌CN247時分別出現(xiàn)了對應的擴增曲線，其余菌株均無擴增曲線；同時，對應的熔解曲線出現(xiàn)單一尖銳的峰，沒有雜峰，說明在本研究的反應體系和反應條件下，3對引物對于耐乙酸乳桿菌菌種CN247檢測具有特異性，參照Ct值和熔解曲線可將CN247與其他11株腐敗菌區(qū)分開來，因此這3對引物可以作為CN247的特異性引物用于12種啤酒腐敗菌中耐乙酸乳桿菌菌種的定性檢測。

2.1.3 耐乙酸乳桿菌特異性引物定性檢測混合DNA模板

為了進一步驗證所篩選引物的特異性，研究中將12個菌種的基因組混合后作為模板，利用篩選的3對引物對目標產(chǎn)物進行擴增，擴增結果如圖2所示。

圖2 YW5、YW6和YW7引物在RT-qPCR上檢測混合DNA的擴增曲線和熔解曲線Fig.2 Amplification curve and melting cuve of detection of mixed DNA by YW5、YW6 and YW7primers on RT-qPCR

如圖2所示，在分別使用3對特異性引物對混合DNA樣品進行擴增時，在多個復雜模板及近緣乳酸菌菌種存在的情況下，檢測體系只對耐乙酸乳桿菌的檢測具有種特異性，說明引物特異性良好。

2.1.4 耐乙酸乳桿菌特異性引物定性檢測同種屬其他耐乙酸乳桿菌

為了進一步驗證設計的特異性引物對另外2株鑒定的耐乙酸乳桿菌2011-3和2011-8檢測的有效性，使用其中1對引物YW5對測試菌株DNA進行PCR擴增，結果如圖3所示。

RT-qPCR測試結果表明，檢測的2株菌2011-3與2011-8為耐乙酸乳桿菌，與分子鑒定的結果相同。說明設計的引物對耐乙酸乳桿菌菌種具有種特異性。

因此，以分離到的12株啤酒污染菌基因組為模板，無論是單一菌DNA還是混合菌的DNA，通過YW5、YW6和YW7三對引物在RT-qPCR上擴增后，均能對樣品中的耐乙酸乳桿菌檢測出唯一的擴增曲線和熔解曲線，同時也能對耐乙酸乳桿菌的菌種進行種特異性有效檢出，表明了3對引物的特異性符合檢測耐乙酸乳桿菌的檢測要求。

2.2 定量檢測結果

2.2.1 耐乙酸乳桿菌DNA標準曲線的建立

以108CFU/mL耐乙酸乳桿菌提取的基因組為基礎，通過10倍梯度稀釋的DNA為模板，以特異性引物YW5對不同梯度的耐乙酸乳桿菌基因組DNA擴增，建立耐乙酸乳桿菌標準曲線，如圖4所示。

圖3 YW5引物在RT-qPCR上檢測耐乙酸乳桿菌2011-3和2011-8的擴增曲線和熔解曲線Fig 3 Amplification curve and melting cuve of detection of strain 2011-3 and 2011-8 by YW5 primer on RT-qPCR

圖4 耐乙酸乳桿菌DNA的標準曲線Fig.4 Standard curve of Lactobacillus acetotoleransDNA

如圖4所示，7個濃度梯度的耐乙酸乳桿菌DNA樣品擴增的標準曲線滿足誤差范圍，其對應的回歸方程y=-3.344X+33.56，R2>0.99，線性關系良好，滿足后續(xù)對標的需要。

2.2.2 標曲的重復性和再現(xiàn)性驗證

選取3人分別使用新開發(fā)的耐乙酸乳桿菌特異性探針YW5，驗證定量標曲(從DNA稀釋至上機為一次操作)的重復性和再現(xiàn)性，每人做6次標曲，實驗結果如表4所示。

如表4所示，每個人測試6次標曲斜率的重復性RSD均在5%以內，3人測試標曲的再現(xiàn)性RSD為3.94%，在5%的合格范圍內，說明標曲的重復性和再現(xiàn)性良好，可以用于實際的檢測。

2.2.3 耐乙酸乳桿菌的最低檢出限

為了進一步確定耐乙酸乳桿菌特異性引物的最低檢出限，將濃度1×108CFU/mL的耐乙酸乳桿菌CN247的原始菌液10倍梯度稀釋，并以最后3個梯度分別進行平板計數(shù)，26℃厭氧培養(yǎng)2 d。再對各梯度的菌液平板計數(shù)，確定樣品培養(yǎng)前后的菌體濃度。培養(yǎng)后的菌液分別取10 mL菌液提取DNA后在RT-qPCR進行檢測，結果如表5所示。

不同梯度接種的樣品經(jīng)預培養(yǎng)2 d后，取10 mL預培養(yǎng)液提取的基因組DNA中均可以檢測到目標菌。其中，經(jīng)預培養(yǎng)的最低稀釋度的4號樣品平板檢測結果為11 CFU/mL。因在提取DNA做RT-qPCR時使用的是10 mL菌液，故上機檢測出來4號樣品對應的菌數(shù)為102CFU/mL。因此，新開發(fā)的特異性探針對耐乙酸乳桿菌的最低檢出限為102CFU，檢測精度為101CFU/mL。

表4 標曲的重復性和再現(xiàn)性結果Table 4 Repeatability and reproducibility results offstandcurve

表5 不同梯度CN247培養(yǎng)2 d后的菌液使用特異性探針RT-qPCR測試結果Table 5 The results of RT-qPCR using the special probeto detecting the suspension of CN247 after cultivation

注：“+”表示結果正常，判定為陽性。

2.3 實際樣品的檢測

應用本研究開發(fā)的耐乙酸乳桿菌特異性引物檢測生產(chǎn)上預培養(yǎng)2 d的20批樣品，并同時進行菌株分析后的樣品測序對比結果如表6所示。

表6 樣品分離鑒定后的測序結果與新開發(fā)探針方法檢測結果Table 6 Sequencing results of isolated and identified sample and test results of newly developed method

注: “+”表示NBB-B液體培養(yǎng)基變色，判定為陽性；“-”表示不變色或未檢測到，判定為陰性。

實驗結果表明，檢測的20批生產(chǎn)樣品經(jīng)預培養(yǎng)2 d后，只要樣品中含有耐乙酸乳桿菌且達到檢出限的樣品，均可以使用本研究開發(fā)的方法進行有效檢測。結果表明，本研究開發(fā)的耐乙酸乳桿菌特異性探針對實際樣品中的耐乙酸乳桿菌檢測具有特異性及準確性，檢出效率為100%。

3 結論

本研究以耐乙酸乳桿菌3個種特異性基因為靶目標，成功設計并優(yōu)化了3對種特異性引物用于啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌的檢測。建立了基于SYBR GREEN實時熒光定量種特異性PCR方法及耐乙酸乳桿菌定量檢測的標準曲線，實現(xiàn)了對耐乙酸乳桿菌的定性與定量檢測。定量檢測的最低檢測限為102CFU/mL，精度為10 CFU/mL。實際樣品經(jīng)富集培養(yǎng)2 d后，可以滿足PCR檢測需求，整個檢測時間可控制3 d以內，特異性探針對生產(chǎn)上含有耐乙酸乳桿菌樣品的檢出率為100%。本研究開發(fā)的方法滿足了啤酒生產(chǎn)企業(yè)對出廠產(chǎn)品進行質量控制的要求，為啤酒或其他食品中新發(fā)現(xiàn)的污染微生物檢測提供了借鑒。