周靈利， 陳維維， 張啟余， 柯 瀟

(成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司， 四川 成都 610037)

0 引 言

鹽酸左旋米那普侖緩釋膠囊作為成人重性抑郁障礙治療的藥品，于2013年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市[1].鹽酸左旋米那普侖作為該制品的原料藥，通過選擇性抑制5—羥色胺(5-HT)轉(zhuǎn)運(yùn)體和去甲腎上腺素(NE)轉(zhuǎn)運(yùn)體，從而抑制5-HT和NE的再攝取，且其對NE的再攝取抑制能力分別是度羅西汀和文拉法辛的27倍和17倍，具有較好的療效.原料藥的有關(guān)物質(zhì)將直接影響藥品的療效和安全性，為了更好保障鹽酸左旋米那普侖緩釋膠囊的質(zhì)量，有必要對其原料藥的有關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行控制.目前，國內(nèi)僅有兩篇該原料藥異構(gòu)體控制的文獻(xiàn)報告[2-3]，國外有關(guān)該原料藥雜質(zhì)控制的文獻(xiàn)相對較多[4-6].但相關(guān)研究都不能完全涵蓋該原料藥中所需要控制的雜質(zhì).對此，本研究根據(jù)鹽酸左旋米那普侖原料藥的合成工藝和強(qiáng)制降解情況，確定需要控制的雜質(zhì)(見圖1)，并采用反相高效液相色譜法測定鹽酸左旋米那普侖原料藥中的多種雜質(zhì)，以對該原料藥的質(zhì)量進(jìn)行控制.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：鹽酸左旋米那普侖，由成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供；

鹽酸左旋米那普侖對照品(批號，PCL-#-M876)、雜質(zhì)E(批號，PCL-#-MH14),購自成都邁斯克醫(yī)藥科技有限公司；雜質(zhì)A(批號，2113-074AJ)，購自TLC公司；雜質(zhì)B(批號，L4X-103302-1411)，購自CATO公司；雜質(zhì)C(批號，20-MAR-14-01)，購自QCC公司；雜質(zhì)D(批號，16-02-1823)，購自SINCO公司；三氟乙酸、甲醇、乙腈均為色譜純試劑.

圖1鹽酸左旋米那普侖原料藥雜質(zhì)譜

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：Ultimate-3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)，BP-211D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司).

2 方法和結(jié)果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：色譜柱為Waters sunfire C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動相以0.05%TFA水溶液為流動相A，以0.05%TFA乙腈溶液為流動相B，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長220 nm；進(jìn)樣量10 μL.

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 溶液配制

1)供試品溶液.取供試品適量，加10%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL約含5 mg的溶液，搖勻，即得.

2)自身對照溶液.精密量取供試品溶液適量，加10%乙腈定量稀釋制成每1 mL約含5 μg的溶液，搖勻，即得.

2.2 結(jié) 果

2.2.1 專屬性

取鹽酸左旋米那普侖有關(guān)物質(zhì)A～E與鹽酸左旋米那普侖標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制每1 mL含有關(guān)物質(zhì)A～E與鹽酸左旋米那普侖各約含5 μg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液；取鹽酸左旋米那普侖有關(guān)物質(zhì)A～E與鹽酸左旋米那普侖標(biāo)準(zhǔn)品適量至不同的量瓶中，分別配制每1 mL約含5 μg的溶液，作為定位溶液；取以上溶液與10%乙腈(稀釋劑)一起，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果如圖2所示.

圖2 專屬性相關(guān)液相色譜圖

由圖2可知，各雜質(zhì)之間以及雜質(zhì)與鹽酸左旋米那普侖之間分離度均符合要求.

2.2.2 破壞性

取鹽酸左旋米那普侖原料藥適量，加10%乙腈稀釋成每1 mL約含鹽酸左旋米那普侖50.0 mg/mL的溶液，作為儲備液.取該儲備液1 mL分別至8個10 mL量瓶中，按表2中的破壞條件分別加入適量處理溶劑，水浴80 ℃/光下處理相應(yīng)時間，取出，放冷，加相應(yīng)試劑中和后，10%乙腈(稀釋劑)稀釋至刻度，搖勻，作為破壞性實(shí)驗(yàn)相關(guān)溶液.取以上溶液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果如圖3所示.

表2 破壞條件

圖3破壞性實(shí)驗(yàn)液相色譜圖

由圖3可知，樣品在酸、堿、氧化、高溫條件下，均產(chǎn)生雜質(zhì)B，且各破壞溶液色譜圖中，主峰峰純度及主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度均符合要求.

2.2.3 重復(fù)性

取供試品溶液6份，分別取10 μL注入液相色譜儀測定雜質(zhì)含量.結(jié)果顯示，雜質(zhì)均未檢出，主峰峰面積的RSD為0.4%，小于1%，表明本方法重復(fù)性較好.

2.2.4 檢測限和定量限

取左旋米那普侖有關(guān)物質(zhì)A～E溶液，逐步稀釋后進(jìn)樣10 μL，以信噪S/N約為3和10時的量作為檢測限和定量限.結(jié)果表明，雜質(zhì)A～E檢測限分別為0.1720、0.5270、0.8667、0.8892、0.0631 μg/mL；雜質(zhì)A～E定量限分別為0.5160、 0.8783、2.600、2.668、0.1683 μg/mL.

2.2.5 溶液穩(wěn)定性

取“2.2.3”項(xiàng)下一份供試品溶液，于常溫放置1、3、5、6、8、9、16、26 h后測定.結(jié)果表明，無新增雜質(zhì)檢出，主峰峰面積RSD為0.3%，均小于1%，說明常溫下，供試品溶液在26 h內(nèi)穩(wěn)定.另取混合對照溶液，于常溫放置1、2、3、4、5、8、12、16、21、29 h后測定.結(jié)果表明，雜質(zhì)A～E的峰面積RSD分別為2.1%、1.7%、3.7%、3.1%、0.25%，均小于4%.結(jié)果表明，常溫下，對照溶液在29 h穩(wěn)定.

2.2.6 耐用性

取鹽酸左旋米那普侖有關(guān)物質(zhì)A～E與鹽酸左旋米那普侖標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制每1 mL含有關(guān)物質(zhì)A～E各5 μg和鹽酸左旋米那普侖5 mg的混和溶液，作為耐用性考察溶液.調(diào)整色譜條件的流速±0.1 mL/min、柱溫±3 ℃或更換色譜柱，取該溶液進(jìn)樣.結(jié)果表明，在不同條件下，按峰面積百分比法計(jì)算各成分的量幾乎不變，雜質(zhì)與雜質(zhì)之間以及雜質(zhì)與左旋米那普侖之間分離度均大于1.5，表明本方法耐用性良好.

2.2.7 線性關(guān)系

取鹽酸左旋米那普侖有關(guān)物質(zhì)A～E與鹽酸左旋米那普侖標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制每1 mL含有關(guān)物質(zhì)A～E與鹽酸左旋米那普侖各50 μg/mL混和溶液作為線性儲備液，并分別精密量取0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL，置于不同的10 mL量瓶中，分別用10%乙腈(稀釋劑)定容，作為線性關(guān)系考察樣品溶液.取以上溶液各10 μL進(jìn)樣，以濃度和峰面積進(jìn)行線性擬合.計(jì)算結(jié)果顯示：雜質(zhì)A，在2.58～7.74 μg/mL濃度范圍內(nèi)，回歸方程為Y=0.4731X-0.0353(R2=0.9996)；雜質(zhì)B，在2.635～7.905 μg/mL濃度范圍內(nèi)，回歸方程為Y=0.3629X+0.0102(R2=0.9965)；雜質(zhì)C，在2.6～7.8 μg/mL濃度范圍內(nèi)，回歸方程為Y=0.1786X-0.0438(R2=0.9895)；雜質(zhì)D，在2.6675～8.0025 μg/mL濃度范圍內(nèi)，回歸方程為Y=0.1322X-0.054(R2=0.9982)；雜質(zhì)E，在2.525～7.575 μg/mL濃度范圍內(nèi)，回歸方程為Y=1.4049X-0.1972(R2=0.998)；鹽酸左旋米那普侖，在2.500～7.500 μg/mL濃度范圍內(nèi)，回歸方程為Y=0.3849X+0.0949(R2=0.9963).結(jié)果表明，在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，有關(guān)物質(zhì)A～E與鹽酸左旋米那普侖的進(jìn)樣濃度與峰面積線性關(guān)系良好.

2.2.8 準(zhǔn)確度

取供試品適量，加10%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL約含50 mg的溶液，搖勻，作為準(zhǔn)確度儲備液，取儲備液1 mL至10 mL量瓶中，分別精密加入0.8、1.0、1.2 mL“2.2.7”項(xiàng)下線性儲備液(每個濃度平行制備3份)，用10%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為準(zhǔn)確度供試液.取準(zhǔn)確度供試液及“2.2.1”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液各10 μL進(jìn)樣，供試品各雜質(zhì)含量均按均未檢出計(jì)算，以雜質(zhì)的測定量和加入量計(jì)算回收率.計(jì)算結(jié)果顯示：雜質(zhì)A的回收率范圍為95.78%～97.88%，平均回收率為96.6%，RSD為0.69%；雜質(zhì)B的回收率范圍為97.80%～106.87%，平均回收率為101.5%，RSD為2.8%；雜質(zhì)C的回收率范圍為91.61%～109.76%，平均回收率為97.33%，RSD為6.5%；雜質(zhì)D的回收率范圍為90.13%～105.99%，平均回收率為94.9%，RSD為5.7%；雜質(zhì)E的回收率范圍為98.08%～101.30%，平均回收率為99.6%，RSD為1.0%.結(jié)果表明，各雜質(zhì)回收率范圍均在80%～120%，RSD均≤10%，本方法準(zhǔn)確度良好.

3 討 論

3.1 降解雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的確認(rèn)

實(shí)驗(yàn)顯示，鹽酸左旋米那普侖堿破壞供試液中檢出2個較明顯的雜質(zhì)，即雜質(zhì)1和雜質(zhì)3(見圖4).通過對該溶液進(jìn)行LC-MS結(jié)構(gòu)解析，初步確定兩降解雜質(zhì)的分子量分別為192與174，通過對鹽酸左旋米那普侖(分子量247)結(jié)構(gòu)式進(jìn)行拆分，本研究確定2個雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式為圖1中的雜質(zhì)B和雜質(zhì)D.

圖4供試液堿破壞液相色譜圖

3.2 紫外吸收光譜檢測

“2.2.1”項(xiàng)下雜質(zhì)A～E和鹽酸左旋米那普侖的定位溶液各主峰光譜圖(見圖5).結(jié)果顯示，除雜質(zhì)E在190 nm、220 nm處有較明顯的吸收峰外，其他雜質(zhì)和鹽酸左旋米那普侖除在190 nm外，無明顯的吸收峰.為了避開末端吸收(190 nm)的干擾，同時確保各雜質(zhì)和主成分均有較強(qiáng)的吸收，本研究選擇220 nm作為檢測波長.

圖5雜質(zhì)與米那普侖光譜圖

3.3 水相添加劑的篩選

相關(guān)研究顯示，雜質(zhì)D極性很強(qiáng)，需要很低比例的有機(jī)相，而雜質(zhì)E極性太差，需要較高比例的有機(jī)相.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以純水為水相時，主峰拖尾嚴(yán)重，而以磷酸鹽為水相時，雜質(zhì)E附近會出現(xiàn)明顯的鬼峰(高比例乙腈與磷酸鹽混合，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象所致)，當(dāng)以0.05%TFA水溶液為水相時，不僅主峰和雜質(zhì)峰峰型良好，且雜質(zhì)E附近基線平穩(wěn).

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，本研究建立的分析方法，各成分分離良好，同時可兼顧極性小的工藝雜質(zhì)和極性大的降解雜質(zhì)，具有簡便快速、準(zhǔn)確靈敏、重復(fù)性好的特點(diǎn)，完全適用于鹽酸左旋米那普侖有關(guān)物質(zhì)測定.