唐春艷， 賀 英， 周楊楊， 程 強， 羿國娟， 魯 蘭

(成都大學 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052)

0 引 言

抗生素的耐藥性問題是當今受到普遍關注的熱點問題，作為耐藥菌之一的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是臨床常見的致病菌，其耐藥機制與分泌的毒力因子有關，包括生物被膜生成，綠膿菌素及彈性蛋白酶分泌等，而這些毒力因子受細菌密度感應(Quorum sensing，QS)系統(tǒng)調控[1-3].有研究發(fā)現(xiàn)，Pa中至少存在2種以上QS系統(tǒng)，分別是以C4-HSL、3-oxo-C12-HSL為信號分子的高絲氨酸內酯系統(tǒng)和以喹諾酮為信號分子的PQS系統(tǒng)[4]，其中又以高絲氨酸內酯系統(tǒng)最具代表性.在該系統(tǒng)中，C4-HSL、3-oxo-C12-HSL分別參與上游主控基因Las、Rhl等的調控[5-7]，其與細菌耐藥性和致病性高度相關，對其進行濃度測定具有重要意義.對此，本研究通過建立一種較為完整的液—質聯(lián)用的方法，用于Pa培養(yǎng)液中C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的濃度測定，并將其應用于清熱解毒中藥金銀花水煎液對Pa的抗菌作用機制的研究中.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：C4-HSL標準品(批號，10007898，規(guī)格為10 mg)，Cayman公司；3-oxo-C12-HSL標準品(批號，09139，規(guī)格為10 mg)，Sigma公司；酮洛芬(含量為99.6%)、銅綠假單胞菌(臨床致病菌株15-23)，四川抗菌素工業(yè)研究所；金銀花(忍冬科植物忍冬的干燥花蕾)，成都同仁堂藥店，經(jīng)本實驗室測定，其最低抑菌濃度(MIC)為100 mg/mL；胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA，7053894)，美國BD公司；胰蛋白胨(01-002)，北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸出粉，成都科龍化工試劑廠；生理鹽水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：Agilent-6410B型質譜儀(美國Agilent公司)，Millipore Simplicity純水機(美國密理博公司))，Sartorius BS-124S型電子天平(德國賽多利斯公司)，XW-80A型渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠)，LDZX-75KBS型立式高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)，ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)，麥氏比濁管(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，DW-86L490型低溫冰箱(青島海爾集團有限公司).

2 方法與結果

2.1 溶液與平板制備

2.1.1 金銀花水煎液制備

稱取干燥金銀花10 g，用潔凈紗布包好置于砂鍋內，加去離子水500 mL，浸泡30 min，大火煮沸，小火繼續(xù)煎1 h，倒出藥液，再加500 mL去離子水，按上述方法再次煎制.將2次藥液合并后濃縮至10 mL，其濃度相當于生藥量1 000 mg/mL，121 ℃滅菌30 min.實驗時，現(xiàn)配現(xiàn)用.

2.1.2 培養(yǎng)平板制備

稱取TSA培養(yǎng)基4 g，加去離子水100 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，制備TSA平板，備用.稱取胰蛋白胨1 g，酵母浸出粉0.5 g，氯化鈉1 g，加去離子水100 mL，調pH值至7.0，121 ℃高壓滅菌30 min，制備肉膏蛋白胨(LB)培養(yǎng)液，備用.

2.2 分析方法

2.2.1 色譜和質譜條件

1)色譜條件.色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×100 mm，2.7 mm)，流動相為80%乙腈—20%水(含0.1%甲酸)；流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為2 μL.

2)質譜條件.采用ESI源，在負離子電離模式下，采用多反應監(jiān)測(MRM)的質譜掃描方式；測定C4-HSL的檢測離子為m/z 172.2→102.1，3-oxo-C12-HSL的檢測離子為m/z 298.3→197.2，毛細管電壓3 500 V，碎裂電壓為90 V；酮洛芬的檢測離子為m/z 255.1→209.1，碎裂電壓為70 V；干燥氣為氮氣，干燥氣流速10 L/min，溫度350 ℃，霧化室壓力30 psi.C4-HSL、3-oxo-C12-HSL及酮洛芬的質譜圖見圖1.

2.2.2 對照品溶液配制

分別精密稱取C4-HSL與3-oxo-C12-HSL對照品各10 mg，置25 mL量瓶中，用去離子水配制成400 μg/mL的C4-HSL母液及400 μg/mL的3-oxo-C12-HSL母液，取C4-HSL與3-oxo-C12-HSL母液適量，用去離子水配制成系列對照品溶液，濃度分別為0.40、1.00、2.00、4.00、6.67、10.0、20.0、40.0 μg/mL.實驗時，現(xiàn)配現(xiàn)用.

精密稱取酮洛芬對照品適量，用甲醇配制成50μg/mL溶液，作為內標(IS)溶液，備用.

2.2.3 樣品處理

取0.22 μm過濾后的培養(yǎng)液樣品2 mL，加入10 μL酮洛芬內標溶液，混勻，再加入4 mL經(jīng)甲酸酸化的乙酸乙酯溶液(含0.5%甲酸)，渦旋提取3 min，靜置分層，取有機相3 mL，氮氣揮干，加入200 μL甲醇復溶后進樣測定.

圖1 3種物質的質譜圖

2.3 方法驗證

2.3.1 專屬性

按“2.2.1”項下色譜和質譜條件，分別測定空白LB培養(yǎng)液、含C4-HSL與3-oxo-C12-HSL LB培養(yǎng)液、金銀花水煎液與銅綠假單胞菌作用后LB培養(yǎng)液，結果見圖2.結果表明，LB培養(yǎng)液中的內源性物質不干擾C4-HSL，3-oxo-C12-HSL以及內標酮洛芬(IS)的測定，C4-HSL，3-oxo-C12-HSL和酮洛芬的保留時間分別為3.6 min、5.5 min和4.4 min，本方法具有較高的靈敏度和特異性.

2.3.2 標準曲線及定量限

取若干份空白LB培養(yǎng)液2 mL，分別加入濃度為0.40、1.00、2.00、4.00、6.67、10.0、20.0、40.0 μg/mL的C4-HSL與3-oxo-C12-HSL系列對照品溶液10 μL，制備成分別含C4-HSL與3-oxo-C12-HSL濃度為2.00、5.00、10.0、20.0、33.4、50.0、100、200 ng/mL溶液，按“2.2.3”項下方法處理后測定.以C4-HSL與3-oxo-C12-HSL濃度為橫坐標，C4-HSL、3-oxo-C12-HSL與內標的峰面積比為縱坐標，制備標準曲線.C4-HSL標準曲線為，Y=0.0043X-0.0045(R=0.9964)，3-oxo-C12-HSL標準曲線為，Y=0.0019X+0.007(R=0.9997)，C4-HSL與3-oxo-C12-HSL線性范圍均為2.00～200 ng/mL，定量下限(LLOQ)均為2 ng/mL.

圖2培養(yǎng)液中C4-HSL、3-oxo-C12-HSL和酮洛芬IS的液—質色譜圖

2.3.3 精密度與準確度

按“2.3.2”項下方法，取適量C4-HSL及3-oxo-C12-HSL系列對照品溶液，用空白LB培養(yǎng)液制備成含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4個濃度和含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60.0 ng/mL 4個濃度的樣品作為質量控制樣品，每一濃度各20份，每日分別取4個濃度各5份，按“2.2.3”項下方法處理后進樣測定，連續(xù)測定3 d，計算批內、批間精密度和準確度，結果見表1、表2.

表1 培養(yǎng)液中C4-HSL的精密度與準確度(n=5)

表2 培養(yǎng)液中3-oxo-C12-HSL的精密度與準確度(n=5)

結果表明，C4-HSL和3-oxo-C12-HSL樣品的批內、批間精密度RSD<7.5%，符合生物樣品測定要求.

2.3.4 提取回收率

按“2.3.2”項下方法，取適量C4-HSL及3-oxo-C12-HSL系列對照品溶液，用空白LB培養(yǎng)液制備成含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4個濃度和含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60.0 ng/mL 4個濃度的樣品作為質量控制樣品，每一濃度各5份，按“2.2.3”項下方法處理后進樣測定，分別記錄C4-HSL、3-oxo-C12-HSL峰面積AC4提取、AC12提取.另取2 mL LB空白培養(yǎng)液，加入酮洛芬內標溶液10 μL后混勻，加入經(jīng)甲酸酸化的乙酸乙酯溶液(含0.5%甲酸)4 mL，渦旋提取，取3 mL有機相，氮氣揮干，再分別加入適量C4-HSL與3-oxo-C12-HSL系列對照品溶液10 μL，氮氣揮干，制成相當于提取前含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4個濃度，含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60 ng/mL 4個濃度的樣品作為未經(jīng)提取樣品，每一濃度各5份.按“2.2.3”方法加入200 μL甲醇復溶后進樣測定，分別記錄C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的峰面積AC4未提取、AC12未提取，以均值比值AC4提取/AC4未提取、AC12提取/AC12未提取表示C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的提取回收率.

在本條件下，C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4個濃度樣品提取回收率分別為87.77±8.39%、89.16±6.04%、88.91±3.72%、91.47±9.56%；3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60 ng/mL 4個濃度樣品提取回收率分別為79.04±8.08%、83.03±6.55%、82.87±4.01%、81.60±3.69%.結果表明，樣品的回收率符合生物樣品測定要求.

2.3.5 基質效應

按“2.3.2”項下方法，另取2 mL純水代替2 mL LB空白培養(yǎng)液，制成含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4個濃度的不含基質的C4-HSL樣品和含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60.0 ng/mL 4個濃度的不含基質的3-oxo-C12-HSL樣品，每一濃度各5份.按“2.2.3”方法加入200 μL甲醇復溶后進樣測定，分別記錄C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的峰面積BC4、BC12，以均值比值AC4未提取/BC4、AC12未提取/BC12表示C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的基質效應.

在本條件下，C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4個濃度的基質效應分別為86.8±2.31%、93.6±1.72%、91.3±2.67%、91.7±4.84%，3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60 ng/mL 4個濃度的基質效應分別為82.8±4.67%、80.2±3.33%、86.3±6.40%、85.8±4.78%.結果表明，LB培養(yǎng)液基質對C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的測定無影響.

2.3.6 樣品穩(wěn)定性

按“2.3.2”項下方法制備含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4個濃度的和含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60.0 ng/mL 4個濃度的質量控制樣品，每一濃度數(shù)份，分別考察于室溫放置2 h、樣品處理后4 ℃放置24 h、-70 ℃凍存15 d和-70 ℃凍融循環(huán)3次的穩(wěn)定性，結果見表3、表4.結果表明，樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，符合生物樣品測定要求.

2.4 金銀花水煎液抗銅綠假單胞菌作用

2.4.1 信號分子濃度測定

取銅綠假單胞菌復蘇于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，

表3 C4-HSL在培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性

表4 3-oxo-C12-HSL在培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性

取單個菌落于無菌生理鹽水中調至5.0麥氏比濁度，用LB液體培養(yǎng)液稀釋10倍，37℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后再用LB液體培養(yǎng)液稀釋30倍，作為稀釋劑備用.取滅菌后生藥量為1 000 mg/mL的金銀花水煎液適量，用上述稀釋劑稀釋10倍至金銀花水煎液濃度為100 mg/mL，再依次稀釋至6、25、100 mg/mL 3個濃度(分別相當于1/16、1/4、1×MIC)，作為含藥組；同法制備不含金銀花水煎液的溶液作為空白對照組.含藥組和空白對照組每組6份，取各組溶液6 mL于相應試管中，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液3 mL測定其中信號分子C4-HSL和3-oxo-C12-HSL濃度.

2.4.2 對信號分子濃度的影響

金銀花水煎液與銅綠假單胞菌共同培養(yǎng)48 h后，含藥組培養(yǎng)液中信號分子濃度與空白對照組比較，結果見表5、圖3.

表5 C4-HSL和3-oxo-C12-HSL在培養(yǎng)液中的濃度

注：*P<0.05，**P<0.01.

圖3 C4-HSL和3-oxo-C12-HSL在培養(yǎng)液中的濃度

結果顯示，C4-HSL濃度明顯降低，3-oxo-C12-HSL濃度明顯升高，此提示即便在亞抑菌濃度條件下，金銀花水煎液也能對銅綠假單胞菌的信號分子濃度產(chǎn)生顯著的影響(P<0.05或P<0.01)，進而對細菌產(chǎn)生耐藥性的基因進行調控.

3 討 論

目前，Pa密度感應系統(tǒng)中信號分子的液—質聯(lián)用測定方法雖有少量文獻報道，但均選擇相同子離子m/z 102.1進行測定，且很不完整，也未見系統(tǒng)的方法學評價[8-10]，在應用于中藥抗耐藥菌機制研究中，由于中藥成分復雜，離子通道容易出現(xiàn)相互干擾而影響測定.本研究針對Pa密度感應系統(tǒng)中C4-HSL、3-oxo-C12-HSL信號分子建立了不同子離子的液—質聯(lián)用測定方法，較好地克服了離子通道的干擾問題.在方法學研究中，由于不能獲得不含C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的空白菌液，因此以空白LB培養(yǎng)液作為基質來進行評價，結果完全符合生物樣品測定要求，體現(xiàn)了本方法的適應性.同時，從清熱解毒中藥金銀花水煎液對Pa密度感應系統(tǒng)中信號分子作用的實驗結果可見，本方法能準確測定Pa培養(yǎng)液中C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的濃度變化，其中，C4-HSL濃度與空白對照組比較明顯減小，3-oxo-C12-HSL濃度明顯增加， 提示金銀花水煎液中可能同時存在能抑制Rhl通路和激活Las通路的成分，體現(xiàn)了中藥多組分、多靶點、協(xié)同作用的特點，此也可為抗Pa耐藥機制研究提供參考.