李鑫玲，康懷彬*，張慧蕓

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽,471023) 2(食品加工與安全國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽, 471023)

近年來，隨著消費(fèi)者安全意識的提高，傳統(tǒng)芳香植物精油及其生物活性化合物作為合成防腐劑的替代品得到了廣泛的研究。精油是具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化作用的揮發(fā)性植物次生代謝產(chǎn)物[1-2]。由于其固有的生物活性、良好的安全性和可生物降解性，大多數(shù)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)為是安全的[3-4]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)中[5-7]。肉桂精油是從肉桂葉和樹皮中提取的，含有較高的丁香酚和肉桂醛，研究表明其對單核增生李斯特菌、腸沙門氏菌、大腸桿菌等革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定的抗菌和抗氧化作用[8]。雖然植物精油具有很好的防腐潛力，但由于其揮發(fā)性高、反應(yīng)性強(qiáng)、水溶性差、分散性不均勻等，會給食品感官品質(zhì)帶來負(fù)面影響[3]，此外，精油還對環(huán)境氧、溫度和光敏感，限制了其作為食品防腐劑的廣泛應(yīng)用。納米封裝技術(shù)為保持精油的穩(wěn)定性，防止揮發(fā)性成分的流失提供了有效的途徑[9-10]，微膠囊化不僅可以掩蓋精油的不良味道和氣味，納米載體還可以保護(hù)精油不被酶降解，控制活性物質(zhì)的釋放，具有獨(dú)特的抗菌性能和較高的表面積/體積比[11]。因此，當(dāng)精油與納米粒子等其他強(qiáng)效抗菌藥物聯(lián)合使用時，其固有的抗菌活性可能通過相互補(bǔ)充來對抗不同類型的病原體，從而大大增強(qiáng)其抗菌活性。

幾丁質(zhì)去乙?；玫降臍ぞ厶亲鳛榈诙S富的多糖，因其無毒、生物降解性和生物相容性，非常適合作為壁材封裝精油。此外，殼聚糖還具有抗菌、抗氧化、殺蟲和黏結(jié)性等廣泛的生物活性，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。國內(nèi)外殼聚糖納米膠囊常用的制備方法有離子凝膠法、共價偶聯(lián)法、大分子復(fù)合法和自組裝法等。其中離子凝膠法制備工藝簡單便捷、反應(yīng)條件溫和、納米粒子粒徑均勻性質(zhì)穩(wěn)定[12]，近年來國內(nèi)外對微膠囊化植物精油方面研究較多，但對于肉桂精油納米膠囊化并對其物理性質(zhì)及體外抗菌抗氧化能力進(jìn)行系統(tǒng)研究的卻鮮有報(bào)道。本文采用離子凝膠化結(jié)合超聲波法制備了以殼聚糖為壁材的肉桂精油納米膠囊，研究殼聚糖與三聚磷酸鈉(tripolyphosphate, TPP)的質(zhì)量比、肉桂精油(cinnamon essential oil, CIEO)與殼聚糖質(zhì)量比及pH值對肉桂精油納米膠囊的粒徑和ζ-電勢的影響。通過拉曼光譜、粒徑分析儀等對其形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并對其體外抗菌抗氧化能力進(jìn)行系統(tǒng)研究，為開發(fā)新型防腐劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖(脫乙酰度95%)，上海藍(lán)季生物試劑有限公司；肉桂精油，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80，分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；多聚磷酸鈉，分析純，天津市津北精細(xì)化工有限公司；肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；冰醋酸，分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；

1.2 儀器與設(shè)備

H2050R臺式高速大容量冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；MS2000型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；Zeta Sizer-2000型Zeta電位測定儀，英國Malvern公司。TM3030Plus型掃描電鏡，日本日立公司；XPLORA ONE 785nm激光拉曼光譜儀，法國HORIBA公司,UV-2450PC型紫外-可見光分光光度計(jì)，85-2型日本島津公司恒溫磁力攪拌器，常州越新儀器制造有限公司；PHS-3C臺式pH計(jì)，上海精科有限公司。

1.3 肉桂精油納米膠囊的制備

采用離子凝膠結(jié)合超聲波法制備肉桂精油納米膠囊[13]。以1%(體積分?jǐn)?shù))冰醋酸為溶劑配置5 mg/mL殼聚糖溶液，經(jīng)1 h超聲水浴后，微孔過濾，調(diào)節(jié)濾液pH值至5.0。將80 mg吐溫-80逐滴添加到加至50 mL的上述殼聚糖濾液中，在60 ℃條件下攪拌30 min得到均勻混合物。取72 mg肉桂精油溶于4 mL無水乙醇，隨后逐滴加入到冷卻的殼聚糖溶液中，常溫?cái)嚢?0 min，殼聚糖/精油的質(zhì)量比為1∶1、0.8∶1，在1 200 r/min條件下攪拌20 min?；旌衔镏屑尤肴?0 mL TPP水溶液形成O/W乳液，1 000 r/min持續(xù)攪拌 50 min，形成肉桂精油納米膠囊。

1.4 肉桂精油納米膠囊的表征

1.4.1 粒徑大小和ζ-電勢

以純凈水為背景，將樣品膠囊均勻分散至水溶液中，控制其濃度在可測試范圍內(nèi)，通過激光粒度分析儀測定膠囊的粒徑大小及分布狀況。采用ζ電位測定儀測定納米膠囊ζ-電勢。

1.4.2 掃描電鏡觀察

將樣品溶液均勻涂在黑色導(dǎo)電膠上，風(fēng)干，進(jìn)樣，在凍干條件下對納米膠囊的形態(tài)進(jìn)行觀察[14]。

1.4.3 拉曼光譜測定

參照SHAO等[15]方法，稍有改動。拉曼光譜激光波長785 nm，功率50 mW，儀器采用單晶珪對頻率進(jìn)行校正，動波長掃描3次，積分時間20 s，檢測范圍400～2 000 cm-1，每個樣品測試3次。

1.5 包埋率和累積釋放率的測定

參照HU等[16]的方法，測定肉桂精油納米膠囊的包埋率和累積釋放率。

精油包埋率計(jì)算公式如公式(1)所示：

(1)

式中：E,包埋率，%；M0,初始精油量，mg；Mn,微膠囊中精油總質(zhì)量，mg。

樣品分散液在4 ℃，9 000 r/min下離心5 min，以分離出肉桂精油納米膠囊，以5 mL醋酸鹽緩沖溶液(pH 5)將其懸浮，混合物在200 r/min旋渦振蕩。在不同的時間間隔取樣，以9 000 r/min離心5 min，然后取出一定體積的上清液加入等體積緩沖溶液，采用紫外分光光度計(jì)測定285 nm下的上清液中釋放出的肉桂精油的量。

精油累積釋放量計(jì)算公式如公式(2)所示：

(2)

式中：Mt,某時刻肉桂精油釋放量;M0,最初納米膠囊中精油負(fù)載量。

1.6 體外抗菌抗氧化性能測定

1.6.1 體外抗菌抗性能

采用抑菌圈法[17]測定了殼聚糖納米膠囊(chitosan nanocapsules, CS-NPs)、CIEO、CIEO- NPs對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抗菌活性。菌株在37 ℃條件下，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基接種0.1 mL對應(yīng)菌。無菌濾紙片(直徑6 mm)分別浸漬CIEO-NPs和CS-NPs水分散液1 mL(0.2 g/mL)，紫外燈下干燥5 min，以CS-NPs為對照。每個培養(yǎng)皿無菌濾紙片周圍抑菌圈的直徑作為衡量其抗菌活性的指標(biāo),每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6.2 體外抗氧化性能測定[18]

將制備好的納米膠囊定量分散于4 mL DPPH乙醇溶液(0.05 mmol/L)中，振蕩反應(yīng)2 h，將反應(yīng)后的混合液離心，在517 nm處測定上清液的吸光度值。抑制率計(jì)算公式如公式(3)所示：

(3)

式中:A0，未檢測樣品的DPPH溶液在517 nm處的吸光度;AS，DPPH與待測樣反應(yīng)后上清液的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖與TPP的質(zhì)量比對肉桂精油納米膠囊的粒徑和ζ-電勢的影響

如圖1所示，隨著CS/TPP質(zhì)量比的增加，肉桂精油納米膠囊的粒徑逐漸增大然后趨于平緩，XIAO等[19]的研究表明CS含量越高，CS-NPs的粒徑越大，與本研究結(jié)果相一致。由于CS濃度的增加，使得CS與TPP的之間很容易發(fā)生離子凝膠反應(yīng)。隨著CS帶正電荷氨基基團(tuán)的增強(qiáng)，CIEO-NPs之間的靜電斥力增強(qiáng)，有效地維持了其穩(wěn)定性[20-21]。此外，隨著CS/TPP質(zhì)量比的增加，CIEO-NPs的ζ-電勢呈先增大后降低的趨勢。這是由于正電荷越多的CS分子在CIEO-NPs表面產(chǎn)生更多游離氨基，當(dāng)CS/TPP質(zhì)量比為7∶1時，殼聚糖分子幾乎被完全交聯(lián)，當(dāng)CS/TPP質(zhì)量比繼續(xù)增加，納米粒子表面電荷降低，不能保持較大粒子的穩(wěn)定性，便造成了粒子絮凝。

圖1 CS與TPP質(zhì)量比對肉桂精油納米膠囊粒徑和ζ-電勢的影響Fig.1 Effects of mass ratio of CS to TPP on particle size and ζ-potential of CIEO-NPs

2.2 肉桂精油與殼聚糖質(zhì)量比對肉桂精油納米膠囊的粒徑和ζ-電勢的影響

不同肉桂精油與CS質(zhì)量比對CIEO-NPs粒徑和ζ-電勢的影響如圖2所示。

圖2 肉桂精油與CS質(zhì)量比對肉桂精油納米膠囊粒徑和ζ-電勢的影響Fig.2 Effects of mass ratio of CIEO to CS on particle size and ζ-potential of CIEO-NPs

隨肉桂精油質(zhì)量的增加，CIEO-NPs的粒徑逐漸增大，ζ-電勢呈先上升后下降的趨勢，在質(zhì)量比為0.8∶1時，ζ-電勢達(dá)到峰值，為35.8 mV。當(dāng)肉桂精油添加量較少時，以細(xì)小的液滴狀均勻地分散在溶液中，CS可以完全封裝分散的肉桂精油液滴。隨著精油添加量的增加，CIEO- NPs的粒徑增大，但其ζ-電勢減小，由于更多的CIEO溶解在膠束中，CIEO-NPs的粒徑繼續(xù)增大。此外，過量的精油將黏附在CIEO-NPs表面，會降低納米膠囊的表面電荷，進(jìn)而導(dǎo)致其聚集，ζ-電勢減小。JOHN等[22]研究結(jié)果表明，一般當(dāng)納米粒子的ζ-電勢絕對值大于30 mV時，其處于穩(wěn)定的狀態(tài)，不易發(fā)生凝聚。因此選擇CIEO/CS質(zhì)量比為0.8∶1。

2.3 pH值對CEO-NPs的粒徑和ζ-電勢的影響

pH值對納米膠囊粒徑和ζ-電勢的影響如圖3所示。殼聚糖是一種堿性多糖，在中性或堿性條件不溶解[23]。殼聚糖的質(zhì)子化程度與溶液的pH值密切相關(guān)，納米膠囊的形成依賴于帶正電荷的CS與帶負(fù)電荷的TPP的相互作用[24]。因此，pH值對納米膠囊的粒徑和ζ-電勢都有顯著影響。隨著pH值的增加，CS分子質(zhì)子化程度降低，ζ-電勢也不斷下降。pH值還可以影響納米膠囊的離子交聯(lián)過程[25]，當(dāng)pH<5時，納米膠囊粒徑逐漸減小，而當(dāng)pH>5時，粒徑大小隨著pH值的增加而增大。當(dāng)pH值較低時，CS與TPP離子間的交聯(lián)反應(yīng)易于進(jìn)行；而當(dāng)pH值過大時，不利于離子交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，便導(dǎo)致了CIEO- NPs的聚集。因此，制備選擇條件pH值為5。

圖3 pH值對肉桂精油-殼聚糖納米膠囊粒徑以及ζ-電勢的影響Fig.3 Effect of pH value of CS solution on particle size and ζ-potential of CIEO-NPs

2.4 肉桂精油納米膠囊的粒徑分布及形態(tài)觀察

圖4、圖5和圖6分別顯示了肉桂精油納米膠囊的粒徑分布及掃描電鏡、顯微鏡圖。由圖4可知，肉桂精油納米膠囊的平均粒徑為178 nm，粒徑分布較窄，呈單分散性。由掃描電鏡(圖5)及顯微鏡圖(圖6)可以看出肉桂精油納米膠囊呈球形，較少有團(tuán)聚，與粒徑分析結(jié)果一致。由此可以看出，制得的肉桂精油納米膠囊具有較高的均一性。

圖4 肉桂精油納米膠囊與空白殼聚糖納米膠囊的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of cinnamon essential oil-loaded chitosan nanocapsule

圖5 肉桂精油納米膠囊的掃描電鏡圖Fig.5 SEM of cinnamon essential oil-loaded chitosan nanocapsule

圖6 肉桂精油納米膠囊的顯微鏡圖Fig.6 Microscope image of cinnamon essential oil-loaded chitosan nanocapsule

2.5 肉桂精油納米膠囊的包埋率和體外釋放

紫外可見分光光度計(jì)結(jié)果可知肉桂精油納米膠囊的包埋率為42.58%，高于WANG和XIAO[26]報(bào)道的殼聚糖負(fù)載肉桂精油納米膠囊的包埋率。圖7為肉桂精油納米膠囊在醋酸緩沖液中的釋放曲線。肉桂精油的釋放曲線呈起始的突釋階段，隨后進(jìn)入平穩(wěn)的釋放延滯期，最終達(dá)到平穩(wěn)期。從90 h的累積釋放結(jié)果可以看出，在最初的12 h內(nèi)肉桂精油完成了突釋，精油的累積釋放率達(dá)到52.84%，這主要是由于大量不穩(wěn)定的結(jié)合在納米膠囊表面的精油瞬時擴(kuò)散導(dǎo)致的。隨后累積釋放量緩慢增加,釋放速率逐漸降低，60 h后趨于穩(wěn)定，累積釋放率上升至61.53%，這主要是由于殼聚糖與TPP分子間的交聯(lián)作用減弱，納米膠囊逐漸降解和精油在納米膠囊中擴(kuò)散作用導(dǎo)致的。90 h后，精油的累積釋放率達(dá)到62.50%，緩釋作用明顯。

圖7 肉桂精油納米膠囊的釋放曲線(pH 5.0)Fig.7 Release curve of cinnamon essential oil nanocapsule at pH 5.0

2.6 肉桂精油納米膠囊的拉曼光譜分析

圖8 殼聚糖(a)，殼聚糖空白膠囊(b)，肉桂精油(c)，肉桂精油納米膠囊(d)拉曼光譜Fig.8 Raman spectum of CS(a)， CS blank capsules(b) and cinnamon essential oil-loaded chitosan nanocapsules(c)

2.7 體外抗菌性能測定

采用抑菌圈法測定肉桂精油納米膠囊對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果。抑菌圈大小與樣品的抑菌活性有關(guān)，抑菌圈越大表明抑菌效果越強(qiáng)，抗菌活性越高。如表1所示，經(jīng)過1 d的培養(yǎng)，空白膠囊、肉桂精油和肉桂精油納米膠囊均產(chǎn)生了明顯的抑菌圈，其中肉桂精油納米膠囊的抑菌效果最好(P<0.05)。CIEO-NPs對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用大于枯草芽孢桿菌。肉桂精油中的許多芳香成分如肉桂醛對多種細(xì)菌均表現(xiàn)出良好的抗菌活性活性[30]，肉桂醛具有破壞和穿透細(xì)菌細(xì)胞壁脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力，可以破壞細(xì)胞膜，使離子及其他細(xì)胞質(zhì)滲漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡[31]。同時，殼聚糖本身具有一定的抗菌活性[32]，因此，在肉桂精油和殼聚糖的協(xié)同作用下，CIEO-NPs的抗菌作用增強(qiáng)。EI-BAROTY等[33]的研究表明肉桂醛對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑制作用，這與本研究結(jié)論相似。

表1 肉桂精油納米膠囊對不同菌的抑制作用 單位：mmTable 1 Antibacterial activity of cinnamon essential oil nanocapsules on different bacterium

注：同一列肩標(biāo)字母(a-c)不同，表示不同處理差異顯著(P<0.05)。

2.8 體外抗氧化性能測定

自由基清除能力是篩選抗氧化活性物質(zhì)普遍采用的一種常用方法[34]，從圖9可以看出，肉桂精油納米膠囊的自由基清除活性明顯優(yōu)于單獨(dú)的肉桂精油，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，肉桂精油的自由基清除活性顯著增強(qiáng)；而作為對照，殼聚糖納米膠囊?guī)缀鯖]有清除自由基的能力。有報(bào)道稱，肉桂油具有較高的DPPH自由基清除活性，與合成抗氧化劑作用相似[35]，雖然有研究報(bào)道殼聚糖納米顆粒的抗氧化性能有限[36]，但在肉桂精油與殼聚糖的協(xié)同作用下，肉桂精油納米膠囊DPPH自由基清除能力顯著提高，抗氧化活性明顯增加。

圖9 肉桂精油納米膠囊對DPPH的清除效果Fig.9 Scavenging activity of cinnamon essential oils nanocapsules on DPPH radical

3 結(jié)論

本研究通過離子凝膠化反應(yīng)制備了粒徑為178 nm、ζ-電勢為33.72 mV的肉桂精油納米膠囊。CIEO-NPs的粒徑大小和ζ-電位與CS與TPP的質(zhì)量比、CS與精油的質(zhì)量比及pH值有很強(qiáng)的相關(guān)性。紫外光譜顯示肉桂精油90 h后的累積釋放量達(dá)到62.50%，說明CIEO-NPs具有良好的緩釋性能。此外，CIEO-NPs對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有顯著的抗菌活性；自由基清除實(shí)驗(yàn)表明CIEO-NPs具有較高的DPPH自由基清除活性?？傊?，本研究制備的CIEO-NPs具有較高的體外抗菌和抗氧化活性，可以作為一種潛在的天然抗菌抗氧化劑在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用；同時為進(jìn)一步系統(tǒng)研究CIEO-NPs物理性質(zhì)及體外抗菌抗氧化能力提供理論基礎(chǔ)。