郭娜，朱桂蘭，劉興運(yùn)，張方艷，王子迎，楊俊杰，陳麗君

(合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥，230061)

花青素是一種黃酮類水溶性天然色素，具有抗氧化、延緩衰老等功能，在食品和化妝品等行業(yè)有巨大潛力，但其穩(wěn)定性較差，易受溫度、pH值、光照等條件影響，因而限制了其使用范圍[1-3]。研究表明通過微膠囊技術(shù)包封、花青素?；吞砑虞o色劑等技術(shù)方法可以顯著提高花青素的穩(wěn)定性[4-7]。

GIUSTI[6]以海藻酸鈉-果膠包裹紫玉米和藍(lán)莓提取物，包埋處理明顯降低了花青素色苷的光降解率。CHEN等[7]使用殼聚糖-硫酸軟骨素包埋接骨木花青素，獲得包埋率較高的微膠囊，并改善了花青素的抗氧化活性和貯藏穩(wěn)定性。ELIF等[8]使用殼聚糖和明膠作為壁材，以黑胡蘿卜提取物為芯材，制備微膠囊，并進(jìn)行了體外釋放實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明殼聚糖含量限制了黑胡蘿卜花青素的釋放[8]。陳虎等[9-13]研究了玫瑰花、黑米花青素的包埋，分別優(yōu)化了其工藝條件，對(duì)微膠囊工藝優(yōu)化和探索花青素微膠囊穩(wěn)定性有重要意義。

微膠囊技術(shù)能夠提高花青素的穩(wěn)定性和控制其釋放作用，是比較流行的一種包埋手段[5,7，14-19]。本論文采用銳孔法制備藍(lán)莓花青素微膠囊，并進(jìn)行體外模擬釋放和貯藏穩(wěn)定性研究，以期提高藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性，為藍(lán)莓花青素的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果，合肥師范學(xué)院藍(lán)莓基地；矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；海藻酸鈉，青島明月海藻集團(tuán)有限公司；胃蛋白酶，上海聚源生物科技有限公司；CaCl2，天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，島津有限公司；S4800掃描電子顯微鏡，日本日立公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；DHZ-DA恒溫振蕩器，蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SHZ-D3真空泵，上海鵬奕儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花青素含量測(cè)定

以矢車菊素-3-葡萄糖苷作為花青素標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

準(zhǔn)確稱取矢車菊素-3-葡萄糖苷，用V(HCl)∶V(甲醇)=1∶9，定容，得到質(zhì)量濃度為5.0、10.0、15.0、20.0及25.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后在520 nm波長下測(cè)其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，矢車菊素-3-葡萄糖苷濃度(C)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)，線性擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

C=47.518A+1.352 7,R2=0.994 1

(1)

式中：A為520nm處吸光度；C為花青素質(zhì)量濃度(μg/mL)。

1.3.2 藍(lán)莓花青素微膠囊制備

藍(lán)莓果經(jīng)粉碎，過60目篩，在體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取2 h，過濾并40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥獲得藍(lán)莓花青素凍干粉，4 ℃保存。

芯材：使用藍(lán)莓花青素凍干粉配制成質(zhì)量濃度0.73 g/L的溶液。

壁材：分別稱取不同質(zhì)量的海藻酸鈉，加水溶解，60 ℃下水浴并攪拌至完全溶解，冷卻至室溫后定容，配制成1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/100 mL質(zhì)量濃度的海藻酸鈉溶液。

按照芯材溶液和壁材溶液體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6混合均勻，避光靜置消泡，得到芯壁材混合溶液。

用不同針頭孔徑的無菌注射器進(jìn)行造粒制珠，將芯壁材混合溶液緩慢滴入到一定質(zhì)量濃度的CaCl2溶液中，形成圓形微膠囊顆粒[13]。

微膠囊顆粒經(jīng)過循環(huán)式真空泵抽濾至無水滴落，用蒸餾水洗滌3次并進(jìn)行抽濾。在520 nm波長下測(cè)量濾液的吸光度，并根據(jù)花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濾液中花青素含量，按公式(2)計(jì)算出藍(lán)莓花青素微膠囊化的包埋率。以矢車菊素-3-葡萄糖苷作為花青素標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

(2)

式中：W，藍(lán)莓花青素包埋率，%；C1，原液花青素質(zhì)量濃度，g/L；V1，原液體積，mL；C2，濾液花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V2，濾液體積，mL。

1.3.3 藍(lán)莓花青素微膠囊體外模擬試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取制備的藍(lán)莓花青素微膠囊，分別加入到60 mL胃模擬液和60 mL小腸模擬液中[5,18]。在水浴恒溫振蕩器中37 ℃，65 r/min條件下反應(yīng)，每隔0.5 h測(cè)1次吸光度，按公式(3)計(jì)算花青素釋放率。

(3)

式中：δ，藍(lán)莓花青素釋放率，%；C3，原液花青素的質(zhì)量濃度，g/L；V3，原液體積，mL；C4，模擬液花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V4，模擬液體積，mL；W，藍(lán)莓花青素包埋率，%。

1.3.4 藍(lán)莓花青素微膠囊穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.4.1 pH對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊影響

準(zhǔn)確稱取負(fù)載有等量花青素的微膠囊與花青素粉末，分別置于20 mL不同pH值的緩沖液中，記錄溶液隨時(shí)間的顏色變化，并分析2 d后的花青素保存率?；ㄇ嗨乇４媛拾凑展?4)計(jì)算：

(4)

式中：η，藍(lán)莓花青素保存率，%；A0，處理前吸光度；A1，處理后吸光度。

1.3.4.2 溫度對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊影響

準(zhǔn)確稱取負(fù)載有等量藍(lán)莓花青素的微膠囊，分別置于pH值為3.0的緩沖液中，緩沖液體積為60 mL，分別置于10、20、40、70、95 ℃條件下，每隔30 min測(cè)定花青素含量，按公式(4)計(jì)算花青素保存率。

1.3.5 藍(lán)莓花青素微膠囊電鏡分析

取適量負(fù)載藍(lán)莓花青素微膠囊固定并噴金處理，觀察其放大800倍的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用軟件Origin 8.5和SPSS 24進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，每組試驗(yàn)平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓花青素微膠囊制備

2.1.1 芯壁材比例與海藻酸鈉對(duì)微膠囊包埋率的影響

芯壁材比例(V∶V)與海藻酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化包埋率影響如圖1所示。

圖1 芯壁材比例和海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊化包埋率影響Fig.1 Effect of ratio of core material to wall material and sodium alginate on the encapsulation rate of microcapsules

由圖1分析可知，芯壁材比例和海藻酸鈉濃度對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的包埋率影響顯著(P<0.05)?；ㄇ嗨匚⒛z囊化包埋率隨芯壁材比例增大先升高后下降，且芯壁材體積比為1∶2時(shí)，藍(lán)莓花青素微膠囊包埋的效率達(dá)到最高值84.00%。這可能是芯壁材比例較大時(shí)，混合溶液較稀，制備的微膠囊呈扁圓形、質(zhì)地松軟，包埋花青素效率低；芯壁材比例較小時(shí)，溶液較黏稠，所需固化時(shí)間長，使得藍(lán)莓花青素溶于固化液，藍(lán)莓花青素的包埋率較低，且成型效果差，微膠囊易拖尾。因而藍(lán)莓花青素的微膠囊化宜選擇的芯壁材最佳比例為1∶2。

隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度增大，藍(lán)莓花青素微膠囊化包埋率升高。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度為1.5 g/100 mL時(shí)，藍(lán)莓花青素微膠囊化包埋率達(dá)到峰值，為87.00%，微膠囊顆粒均勻，整體外觀為球狀。海藻酸鈉質(zhì)量濃度超過1.5 g/100 mL時(shí)，藍(lán)莓花青素微膠囊化包埋率下降顯著，可能是海藻酸鈉濃度較高導(dǎo)致其溶液黏度大，流動(dòng)性變差，制備難度增加，微膠囊拖尾現(xiàn)象明顯，影響微膠囊的成型，從而使得藍(lán)莓花青素包埋率下降，這一結(jié)果與楊艷等[16]制備的微膠囊的針頭孔徑影響規(guī)律基本一致。

2.1.2 CaCl2與針孔尺寸對(duì)微膠囊包埋率影響

CaCl2與針孔尺寸對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的包埋率影響均顯著(P<0.05)，其結(jié)果如圖2所示。藍(lán)莓花青素微膠囊化的包埋率隨CaCl2濃度的增加而提高，當(dāng)CaCl2為1.5 g/100 mL時(shí)，藍(lán)莓花青素的包埋率達(dá)到最大值為89.37%；繼續(xù)增大濃度后，藍(lán)莓花青素微膠囊化包埋率反而降低。這可能是由于CaCl2濃度影響微膠囊成型效果，CaCl2濃度較低時(shí)制備的微膠囊產(chǎn)品質(zhì)地松軟，極易破碎，而濃度較高時(shí)，形成海藻酸鈣層結(jié)構(gòu)較為致密，但內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分布不均勻[10]，也不利于微膠囊產(chǎn)品的干燥加工。

圖2 CaCl2與針孔尺寸對(duì)微膠囊化包埋率影響Fig.2 Effect of CaCl2 and needle diameter on the encapsulation rate of microcapsules

針頭孔徑影響制備的微膠囊直徑大小，也直接影響微膠囊的包埋率。隨著針頭孔徑增大，藍(lán)莓花青素微膠囊化的包埋率增加，針頭孔徑為0.60 mm時(shí)，藍(lán)莓花青素微膠囊包埋率達(dá)到最大值88.58%；針頭孔徑繼續(xù)增大時(shí)，藍(lán)莓花青素微膠囊化的包埋率反而下降，這可能是由于針頭孔徑增大使微膠囊表面積增大，從而可以容納更多的花青素，但微膠囊在CaCl2溶液中固化時(shí)間增長，藍(lán)莓花青素溢出的量增加，從而降低了包埋率。綜上分析可知，最佳制備藍(lán)莓花青素微膠囊的注射器針頭孔徑為0.60 mm。

綜上可知，藍(lán)莓花青素微膠囊最佳試驗(yàn)組合方案為芯材和壁材比例為1∶2、海藻酸鈉質(zhì)量濃度1.5 g/100 mL、CaCl2濃度1.5 g/100 mL、針頭孔徑0.60 mm。對(duì)最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該試驗(yàn)條件下藍(lán)莓花青素微膠囊包埋率達(dá)到90.17%。

2.2 花青素微膠囊掃描電鏡

由圖3掃描電鏡圖可知，藍(lán)莓花青素微膠囊外觀呈球狀，微膠囊外觀除部分凹凸不平和塌陷外，整體飽滿充實(shí)完整，其表面光滑連續(xù)性好，無破裂現(xiàn)象和裂痕出現(xiàn)，表明海藻酸鈉用作包埋藍(lán)莓花青素的壁材，可以起到很好的支撐作用。

圖3 花青素微膠囊微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 SEM of the anthocyanin microcapsule

2.3 藍(lán)莓花青素體外模擬試驗(yàn)

由圖4可知，藍(lán)莓花青素微膠囊在模擬胃液環(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定，并且藍(lán)莓花青素釋放率低。藍(lán)莓花青素微膠囊在胃模擬液中的花青素在0～2 h時(shí)釋放率升高，2 h以后，花青素的釋放率保持平緩，釋放率達(dá)到最高值25.17%。在小腸液體外模擬試驗(yàn)中，花青素釋放率在4 h時(shí)，花青素基本完全釋放，繼續(xù)延長時(shí)間，花青素釋放率趨于平穩(wěn)，微膠囊花青素的釋放率最高89.26%。

圖4 藍(lán)莓花青素微膠囊產(chǎn)品體外模擬釋放試驗(yàn)Fig.4 Release curve of the anthocyanin microcapsule in vitro

綜上分析可知，海藻酸鈉作為1種腸溶性壁材，有較好的耐酸性和腸溶性，可以起到控制花青素緩釋的作用。這一結(jié)果也與玫瑰茄花色苷微膠囊的釋放性規(guī)律一致[19]。

2.4 藍(lán)莓花青素微膠囊穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1 pH值對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊影響

pH值對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊和穩(wěn)定性影響如圖5和圖6所示。

a-花青素微膠囊;b-花青素粉末；上排為初始，下排為2 d后圖5 pH值對(duì)藍(lán)莓花青素貯藏前后色澤的影響Fig.5 Effect of pH on color of blueberry anthocyanin before and after storage

圖6 pH值對(duì)藍(lán)莓花青素的貯藏穩(wěn)定性影響Fig.6 Effect of pH on storage stability of blueberry anthocyanin

由圖5可知，在pH值為3～12的緩沖液中，藍(lán)莓花青素微膠囊溶液顏色差異顯著(P<0.05)，這是由于藍(lán)莓花青素分子在不同pH值條件下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使溶液色澤發(fā)生變化。在pH值為3～6時(shí)，以紅色的黃烊鹽陽離子形式存在，隨著pH值增大逐步轉(zhuǎn)變成無色的假堿和查爾酮形式存在，pH>7后花青素以藍(lán)色醌型堿形式存在[20]，因而花青素在不同溶液中色澤不同，且其吸光度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。常溫貯藏2 d后，不同pH值條件下的微膠囊和粉末的花青素穩(wěn)定性如圖6所示。在pH值為3和8時(shí)，花青素微膠囊和花青素粉末狀保存率較高，且微膠囊后的花青素保存率高于粉末狀組，由此可知，花青素經(jīng)膠囊處理可以提高其穩(wěn)定性?；ㄇ嗨胤勰┰趐H>8后，保存率下降，可能是花青素在強(qiáng)堿條件下發(fā)生降解所致。微膠囊化的花青素在pH值為9時(shí)仍有較高保存率，也說明了經(jīng)過微膠囊化處理可以提高花青素的穩(wěn)定性范圍。

2.4.2 溫度對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊的影響

如圖7所示，不同溫度下的花青素微膠囊穩(wěn)定性顯著不同(P<0.05)。在環(huán)境溫度低于20 ℃時(shí)，藍(lán)莓花青素較穩(wěn)定，隨著時(shí)間延長，藍(lán)莓花青素微膠囊的保存率基本保持不變；當(dāng)溫度高于20 ℃時(shí)，微膠囊中藍(lán)莓花青素發(fā)生降解，花青素的保存率明顯下降；溫度越高，藍(lán)莓花青素降解速度越快，花青素的保存率越低。在溫度達(dá)到95 ℃，加熱3.0 h后，微膠囊中花青素的保存率下降到17.91%，同時(shí)對(duì)比未包埋組的花青素，可以看出花青素經(jīng)微膠囊處理后的保存率高于粉末狀花青素組數(shù)據(jù)，說明藍(lán)莓花青素經(jīng)微膠囊處理后對(duì)熱的穩(wěn)定性有所提高。

圖7 溫度對(duì)藍(lán)莓花青素貯藏穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of temperature on storage stability of anthocyanin

3 結(jié)論

藍(lán)莓花青素微膠囊的制備以花青素微膠囊化包埋率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，確定藍(lán)莓花青素微膠囊制備最佳工藝條件為：芯材與壁材體積比為1∶2、海藻酸鈉質(zhì)量濃度1.5 g/100 mL、CaCl2質(zhì)量濃度1.5 g/100 mL、針頭孔徑0.60 mm，此條件下制備的藍(lán)莓花青素微膠囊包埋率最高。掃描電鏡顯示藍(lán)莓花青素微膠囊，其表面光滑完整，整體呈球狀結(jié)構(gòu)，微膠囊大小均勻。

藍(lán)莓花青素微膠囊體外模擬結(jié)果表明，以海藻酸鈉為壁材制備的藍(lán)莓花青素微膠囊有控制緩釋的作用，具有良好的耐酸性和腸溶性。在模擬胃液環(huán)境中，花青素的釋放率低，持續(xù)釋放2 h達(dá)到穩(wěn)定，釋放率達(dá)到25.17%；在模擬小腸液環(huán)境中，4 h內(nèi)花青素持續(xù)釋放，釋放率達(dá)到89.26%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)表明經(jīng)微膠囊處理后的花青素對(duì)pH值和溫度穩(wěn)定性均有提高。