崔乃元,趙義良,馬立才,李云*
1(北京維德維康生物技術有限公司,北京,100095)2(石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心,河北 石家莊,050041)
氯霉素(chloroamphenicol,CAP)是一種價格低廉且高效的廣譜抗生素,對多種有害細菌有較好的抑制作用,在水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛的應用[1-2]。但氯霉素有較強的副作用和毒性,當動物源性食品隨著食物鏈被人體長期攝入,可引發(fā)多種疾病[3-4]。為了保護消費者健康,我國農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定氯霉素為禁用藥物,在動物性食品中不得檢出[5-6]。
目前,水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測的主要方法有色譜方法、膠體金免疫層析法和ELISA等方法。色譜方法一般需要昂貴的檢測儀器,檢測成本高,不適合基層檢測。膠體金可以用于基層檢測但不能定量,ELISA則需要反應時間過長。時間分辨免疫層析技術兼具了膠體金和ELISA的優(yōu)點,廣泛應用于藥物殘留的檢測當中。時間分辨熒光免疫分析技術(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是以鑭系元素(包括Eu、Tb、Sm、Dy等)作為標記物,綜合免疫反應的高特異性和鑭系元素標記的高靈敏性相結合而建立的一種新型非放射性免疫檢測技術[7-9]。張藝等[10]利用直接競爭時間分辨熒光免疫法檢測牛奶中氯霉素的含量,測得該方法的靈敏度為0.01%,但在水產(chǎn)品中還沒有應用此方法,由于水產(chǎn)品基質(zhì)復雜,需要建立一種快速、靈敏度高的方法來檢測水產(chǎn)品中氯霉素殘留。
本研究擬利用銪微球作為抗體標記物建立一種簡單、快速、高靈敏的魚、蝦和蟹中氯霉素殘留的熒光定量免疫層析檢測方法,并對所建立方法的靈敏度,準確性和精密度等指標進行評價,以期提供一種適用于水產(chǎn)品中氯霉素痕量殘留的快速檢測方法,保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和消費者健康。
1.1.1 儀器
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國Thermo Fisher Scientific公司;樣品粉碎機(九陽JYL-C090),購自九陽公司;檢測卡恒溫孵育器(WH-400)和時間分辨熒光免疫定量分析儀(FQ-S2,365 nm/610 nm),由維德維康生物技術有限公司研制。
1.1.2 試劑
甲醇、乙腈、K2HPO4、HCl、NaOH、吐溫20、乙酸乙酯和正己烷等,購自國藥集團化學試劑有限公司;牛血清蛋白(BSA),購自美國Amresco公司;200 nm羧基化銪微球(365/610 nm,λex/λem),購自美國Creative Diagnostics公司;硝酸纖維素膜(NC膜),購自美國Millipore公司;樣品墊、吸收墊、PVC底板,均購自上海良信科技有限公司。
氯霉素標準品,購自美國Sigma公司;儲備液配制:準確稱取1.0 mg氯霉素標準品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成100 mg/L的標準品儲備液,于-20 ℃保存,備用。
氯霉素單克隆體G375-5與羊抗鼠二抗,由北京維德維康生物技術有限公司制備。
泰心醫(yī)院一向關注小兒先心病的預防與治療,目前與國內(nèi)外多個慈善項目開展全方位合作,免費為來自27個省區(qū)市、18個民族的11000多名孤、貧先心病兒童實施了先心病根治手術。醫(yī)院還與天津市婦兒保健中心合作,在國內(nèi)率先開展兒童先心病篩查工作,已篩查110余萬兒童,有手術指征的患兒得到了及時手術。
1.1.3 食品樣品
魚、蝦、蟹水產(chǎn)品,購自石家莊市的某超市和農(nóng)貿(mào)市場。
1.2.1 熒光微球的抗體標記
本研究采用200 nm羧基化時間分辨熒光微球,在抗體標記方法[11]的基礎之上,進行了優(yōu)化。具體標記方法如下:(1)50 μL熒光微球中加入450 μL活化緩沖液(0.05 mol/L MES,pH 5.0),超聲5 min;(2)然后,向微球溶液中依次加入EDC和NHS溶液使其終濃度為分別為0.1和0.2 mmol/L,室溫振蕩反應30 min,15 000×g離心10 min,棄去上清液;(3)將沉淀用500μL偶聯(lián)緩沖液(0.04 mol/L PB,pH 8.0)復溶,超聲5 min,加入10 μL 2 mg/mL氯霉素單克隆抗體,室溫振蕩反應2 h,15 000×g離心5 min;(4)向沉淀中加入500 μL封閉緩沖液(0.01 mol/L PB,2%BSA,pH 8.0),4℃振蕩反應過夜;(5)將反應液以15 000×g離心5 min,棄去上清,加入1 mL的Tris-HCl(1% BSA,0.5% Tween-20,0.02% Proclin-300,pH 7.0)復溶沉淀,超聲5 min,4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 試紙條的組裝
用劃膜儀將氯霉素抗原(1.8 μg/mL,1∶6稀釋)和羊抗鼠IgG(17.5 μg/mL,1∶10稀釋)包被于NC膜上作為檢測線(T線,0.7 μL/cm)和質(zhì)控線(C線,0.7 μL/cm),置于37℃烘箱中過夜干燥。將羧基化銪微球標記的氯霉素單抗噴于釋放墊上,噴量為3.0 μL/cm,置于37℃烘箱中干燥2 h。然后,將樣品墊、釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘PVC底板上,并用切割機切成3.95mm寬度的試紙條。
1.2.3 樣本前處理
取魚、蝦、蟹可食用肌肉組織的樣本,稱取 3 g均質(zhì)后的樣品置于50 mL離心管中,加入 6 mL的乙酸乙酯,渦動1 min,放到搖床上(300 r/min)振搖10 min。取出后離心(4 000×g)10min,取4 mL上層乙酸乙酯置于新的離心管中,50~60 ℃水浴條件下氮氣吹干;向吹干的離心管中加入2 mL正己烷,充分渦動10s,再加入1 mL 10 mmol/L PB(2% BSA,0.5% Tween-20,1%蔗糖),低速渦動 1 min后(4 000×g以上),離心 5 min,完全棄去上層正己烷及中間層雜質(zhì),取50 μL下層溶液進行檢測。
1.2.4 檢測步驟
取100 μL稀釋后的樣本提取液滴加至氯霉素免疫熒光層析裝置(圖1)中的樣本墊上,40℃檢測卡恒溫孵育器中準確反應5 min后,取出并使用熒光免疫定量分析儀檢測。
1.2.5 標準曲線的繪制
取魚、蝦、蟹陰性樣品各8份(每份不少于100g),向其中添加氯霉素標準溶液使其終濃度分別為:0.00,0.05,0.10,0.20,0.40,0.80和1.60 μg/kg充分混勻后,按照1.2.3進行樣本提取。然后,按照1.2.4進行檢測。每個濃度重復檢測5次,取平均值,以添加樣本中氯霉素的終濃度為X軸,檢測線T熒光信號值與質(zhì)控線C熒光信號值的比值(T/C)為Y軸,用Origin 8.0 (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA)做非線性擬合分析,形成四參數(shù)擬合曲線如公式(1)所示:
(1)
1.2.6 最低檢測限
取經(jīng)儀器方法[12]確證為氯霉素陰性的魚、蝦、蟹樣品各20份,按照上述所建立的樣本前處理和氯霉素時間分辨熒光免疫層析方法進行檢測。分別計算20份魚、蝦、蟹的平均值和標準差,平均值加上9倍標準差,即為定量限。
1.2.7 準確度和精密度
分別取均質(zhì)后的魚、蝦、蟹空白樣品各20份,分別加入氯霉素溶液,并使其終濃度為0.1、0.2、0.4和0.8 μg/kg,每個濃度梯度添加5個平行;分別按照1.2.3和1.2.4進行樣本提取和檢測。最后,依據(jù)添加回收數(shù)據(jù)對所建立時間分辨熒光免疫層析定量分析方法的準確度和精密度進行分析。
1.2.8 實際樣品與HPLC-MS/MS檢測結果的比對
取魚、蝦、蟹樣品各10份,每份分別采用所建立的時間分辨熒光免疫層析定量分析法和GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》中液相色譜-質(zhì)譜方法進行檢測,并對兩種方法檢測結果的一致性進行分析。
通過測試數(shù)據(jù)的擬合表明,所建立的氯霉素時間分辨熒光免疫層析定量檢測方法對應魚、蝦和蟹樣本的標準曲線(圖1)依次分別如公式(2)、(3)、(4)所示:
(2)
(3)
(4)
利用所建立的氯霉素時間分辨熒光免疫層析檢測方法對魚、蝦和蟹真實樣本的測試數(shù)據(jù)如表1所示,依據(jù)20個樣本的所測平均值和標準差計算得到該方法對魚、蝦和蟹樣本中氯霉素的定量檢測限依次分別為:0.084,0.096和0.091 μg/kg。為了避免假陽性的發(fā)生,將水產(chǎn)中定量限均定為0.1 μg/kg。
圖1 魚、蝦、蟹樣本標準曲線的建立Fig.1 Establishment of a standard curve for fish,shrimp and crab samples
表1 魚、蝦和蟹空白樣品的氯霉素測定結果 單位:μg/kg
在魚、蝦、蟹樣本中依次添加LOQ、2LOQ、4LOQ、8LOQ的CAP標準物質(zhì)。確定免疫層析方法對添加了不同濃度氯霉素魚、蝦和蟹樣本的檢測數(shù)據(jù)。分析結果顯示,本文對水產(chǎn)品中氯霉素的添加回收率為73.5%~114.2%,變異系數(shù)3.9%~11.5%,表明該方法具有較好的準確度和精密度。
同時使用本研究所建立的時間分辨熒光免疫層析方法和國標HPLC-MS/MS法對添加了0.1、0.2、0.4和0.8 μg/kg的魚、蝦、蟹樣本進行了測定,其測試結果如圖2所示。上述兩種方法檢測結果的線性相關方程為:Y=0.02+1.07X,相關系數(shù)R2=0.973。由此可知,2種方法對魚、蝦和蟹中氯霉素檢測結果一致性較高。
氯霉素是一種廣譜的抗菌藥物,對革蘭氏陰性菌和陽性菌均具有較強的抑制作用。鑒于其高效、廣譜的抗菌活性,氯霉素在水產(chǎn)動物細菌性疾病的防治過程中發(fā)揮了重要作用[13-14]。氯霉素的水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的使用,可能會引起水產(chǎn)品中氯霉素殘留的產(chǎn)生。氯霉素可通過抑制骨髓造血機能而引起人類非劑量依懶性再生障礙性貧血。為了防止水產(chǎn)品中氯霉素的殘留危害消費者健康,目前美國和歐共體已禁止在食用性動物中使用氯霉素,并規(guī)定在動物源性食品中不得檢出;我國農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235 號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定氯霉素為禁用藥物,在動物性食品中不得檢出。為了能夠更加簡單、高效地對水產(chǎn)品中氯霉素殘留進行檢測,本研究建立了一種水產(chǎn)品氯霉素時間分辨熒光免疫層定量檢測方法。本研究使用鑭系元素銪(365 nm/610 nm,λex/λem)的羧基微球作為抗體標記物建立免疫層析方法。銪元素具有較大的Stokes位移(>200 nm),因此檢測過程中激發(fā)的信號不會對發(fā)射光的熒光信號造成干擾;另外,鑭系元素的熒光壽命相對比較長,可達1~2 ms,故而可待其他熒光信號消失之后再行檢測,以達到降低背景信號干擾的目的。Stokes位移大和熒光壽命長兩個方面的優(yōu)勢極大地提高了時間分辨熒光免疫分析方法的靈敏度。
表2 準確性和精密度實驗結果 單位:μg/kg
圖2 氯霉素時間分辨熒光免疫層析與HPLC-MS/MS檢測結果Fig.2 Detection results of TRFIA and HPLC-MS/MS
同傳統(tǒng)的膠體金免疫層析方法相比,本研究所建立時間分辨熒光免疫層析方法具有更高的靈敏度,且可以對水產(chǎn)品中氯霉素進行定量檢測。ZHOU等[15]用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中氯霉素殘留物,檢測其檢測限為0.5 μg/kg。桑麗雅等[16]利用膠體金免疫層析技術研制了一種水產(chǎn)品(魚和蝦等)中氯霉素定性檢測方法,其檢測限為0.3 μg/kg。另外,張燕等[17]針對豬肉、雞肉和鱈魚樣本中氯霉素殘留優(yōu)化建立了滲濾式和側流式兩種膠體金標記的免疫競爭快速篩選方法,兩種方法的定性檢測限分別為0.8 μg/L和1 μg/L。本研究所建立的時間分辨熒光免疫層析定量檢測方法的定量檢測限為0.1 μg/kg,顯著地低于膠體金的定性檢測限。
另外,本研究所建立的熒光免疫層析檢測方法基本達到了酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的靈敏度水平。PENG等[18]采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢測魚肉中氯霉素的殘留量,其魚肉中的檢出限為0.126 μg/kg,回收率超過88.1%。ZHANG等[19]采用ELISA和GICA的方法檢測水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量,測得檢出限為1.000 μg/kg。李曉云等[20]建立的直接競爭ELISA檢測氯霉素殘留的方法,對豬肉、雞肉和蜂蜜中氯霉素的檢測限達到0.1 μg/L,線性范圍0.1~100 μg/L,回收率61.0%~102.0%。薩仁托雅等[21]建立了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的酶聯(lián)免疫方法,結果顯示該方法的檢出限為0.05 μg/kg,線性范圍為0.05~4.05 μg/kg,回收率為85.3%~111.3%。相比于ELISA方法,熒光免疫層析的操作更為簡單,檢測時間短(8~10 min),對檢測人員的技術要求相對較低;同時,簡單的操作可以避免一些認為實驗誤差帶來的結果不準確。
WU等[22]使用基于石墨烯的SPE結合HPLC-MS/MS測定水產(chǎn)品中的氯霉素,測定其線性范圍為0.510 0 ng/mL,回收率為92.3%至103.4%。吳明媛等[23]利用毛細管電子捕獲氣相色譜法測定魚肉中氯霉素的殘留量,該方法對魚肉中氯霉素的檢出限為0.1 μg/L,線性范圍為1.0~200 μg/L,線性相關系數(shù)R2>0.996。上述儀器方法與本研究建立的時間分辨熒光免疫層析的靈敏度基本一致,但這些方法一般需要昂貴的大型儀器,技術要求和檢測成本高,且檢測時間較長,不適合大量的樣品檢測,而熒光免疫層析的方法操作簡單易學,檢測成本低,易于上手。
綜上所述,本研究采用時間分辨熒光免疫分析技術建立了一種水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的快速檢測方法。方法的檢測靈敏度(定量限0.1 μg/kg)優(yōu)于傳統(tǒng)的膠體金熒光免疫層析技術,達到了酶聯(lián)免疫吸附方法和儀器方法的靈敏度水平;該方法對水產(chǎn)品中氯霉素的添加回收率(73.5%~114.2%)和變異系數(shù)3.9%~11.5%均能滿足檢測要求,與國標儀器檢測方法的符合率較高。因此,本研究建立的時間分辨熒光免疫層析方法在水產(chǎn)品氯霉素檢測工作具有較高應用價值和應用前景。