韓經(jīng)，肖冬光*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

乳酸乙酯作為白酒四大酯之一[1]，是白酒中重要的呈味物質(zhì)[2-3]，其含量的高低直接影響酒的風(fēng)格[4]，在水味重酒味淡薄的酒中，能對酒的后味進(jìn)行緩沖和平衡，消除酒的水味，增加濃厚感[5]。白酒生產(chǎn)中乳酸乙酯是由乳酸菌代謝產(chǎn)生的L-乳酸和釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇經(jīng)化學(xué)反應(yīng)或在酯化酶的作用下生成[6-8]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其中主要以化學(xué)合成為主[9-10]，且合成速度非常緩慢[11]。

眾所周知，乳酸不同于其他有機(jī)酸，其含有一個不對稱的碳原子，因此具有旋光性，分為L-乳酸和D-乳酸，而在自然界中有很多微生物都同時生成L-乳酸和D-乳酸[12-13]，且不同菌種，不同工藝所產(chǎn)L/D-乳酸的比例不盡相同[14]，而在白酒生產(chǎn)中相較于L-乳酸，D-乳酸因其不易被酯化利用而造成發(fā)酵酸度較高，從而影響酒醅正常的糖化發(fā)酵[15]，同時近年來隨著白酒清潔化生產(chǎn)的推進(jìn)[16]，出現(xiàn)了基酒中乳酸乙酯含量不足的問題，這給白酒生產(chǎn)的質(zhì)量帶來很大影響。本文通過黑曲酯化酶對L/D-乳酸酯化能力的比較，并對7株乳酸菌在不同原料，不同初始糖度的乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基上產(chǎn)L-乳酸性能比較[17]，初步確定白酒用L-乳酸的發(fā)酵工藝，為今后乳酸菌強(qiáng)化發(fā)酵和高乳酸乙酯調(diào)味酒中的制備奠定基礎(chǔ)[18]，改善酒的質(zhì)量，提升酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑與原料

L-乳酸、D-乳酸、乙醇(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；液化酶、糖化酶、酸性蛋白酶，諾維信有限公司；玉米、大米、麥根，超市。

1.1.2 菌種

黑曲霉(Aspergillusniger)T103、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)L1、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)P1、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)P5、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)L3、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)L5、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)L8、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)B1，取自本實驗保藏菌種。

1.1.3 培養(yǎng)基

麩曲固體培養(yǎng)基(g)：(1)試管培養(yǎng)(一級種)：稱取一定量的麩皮，加水65 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右，拌勻后分裝試管，厚度為2.0 cm，121 ℃滅菌20 min。(2)三角瓶培養(yǎng)(二級種)：稱取一定量的麩皮，加水80 %，充分拌勻，裝入500 mL角瓶內(nèi)，厚度為2.0 cm，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、蛋白胨10.0、牛肉膏10.0、酵母膏5.0、檸檬酸二胺2.0、K2HPO42.0、乙酸鈉8.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.05、Tween-80 1.0 mL，自然pH，115 ℃高壓滅菌20 min。

乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基：

(1)大米300 g，麥根30 g，加水1 L，以原料總量添加液化酶5 U/g,于90 ℃水浴液化30 min，之后煮沸30 min，待冷卻到60 ℃時加入糖化酶150 U/g，60 ℃保溫糖化4 h，待冷卻到40 ℃，加入活化好的酸性蛋白酶5 U/g，調(diào)節(jié)糖度，自然pH，115 ℃高壓滅菌20 min。

(2)玉米300 g，麥根30 g，加水1 L，以原料總量添加液化酶5 U/g,于90 ℃水浴液化30 min，之后煮沸30 min，待冷卻到60 ℃時加入糖化酶150 U/g，60 ℃保溫糖化4 h，待冷卻到40 ℃，加入活化好的酸性蛋白酶5 U/g，調(diào)節(jié)糖度，自然pH，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

EL20實驗室pH計，梅特勒儀器(上海)有限公司；手持糖度折光儀WYT-1，上海精密儀器儀表有限公司；DHP恒溫培養(yǎng)箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；BXW-360SD-G立式壓力滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；Agilent 7890B 氣相色譜儀，美國安捷倫科技公司；L/D-LACTATE試劑盒，Megazyme公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑曲酯化酶麩曲培養(yǎng)

將滅菌的一級麩曲試管接種黑曲霉孢子，置于30 ℃培養(yǎng)48 h，菌絲體遍布麩皮，置于37 ℃培養(yǎng)箱烘干，振蕩打散即為一級種子。待冷卻后將一級種接入三角瓶二級麩皮培養(yǎng)基中，充分搖勻，30 ℃培養(yǎng)40 h，待菌絲體布滿并將麩皮連成餅狀時進(jìn)行扣瓶，使麩皮脫離底部繼續(xù)培養(yǎng)1 d，即可出瓶。出瓶后置于牛皮袋內(nèi)，于37～40 ℃快速烘干(含水量< 12 %)，充分打散并保存。

1.3.2 乳酸發(fā)酵液的制備

乳酸菌的活化：取一環(huán)保藏斜面上的乳酸菌接種于裝有5 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

種子液的制備：將活化好的乳酸菌培養(yǎng)液按5 %(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

將乳酸菌種子液按10 %的接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，添加3.0 %無菌CaCO3，密封，于35 ℃條件下靜置發(fā)酵。

1.3.3L/D乳酸對黑曲霉酯化酶催化活力的影響

按照1.3.1的方法制成黑曲酯化酶麩曲，并在乙醇體積分?jǐn)?shù)為20 %的100 mL乙醇溶液中，實驗組分別添加總量1 g的不同比例的L-乳酸，D-乳酸作為底物，加入5 g烘干麩曲，以不添加烘干麩曲為對照組，按照1.3.5.5的方法，靜置酯化7 d，測定乳酸乙酯酯合成量。

1.3.4 高產(chǎn)L-乳酸發(fā)酵工藝的確定

1.3.4.1 不同乳酸菌在兩種發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵性能的比較

由于黑曲酯化酶對L-乳酸的酯化效果更好，而自然界中的各乳酸菌產(chǎn)L-乳酸的比例不盡相同，為黑曲酯化酶能更好地應(yīng)用于高乳酸乙酯調(diào)味酒的制備與生產(chǎn)，因此取7株乳酸菌(干酪乳桿菌L1、乳酸片球菌P1、戊糖片球菌P5、短乳桿菌L3、保加利亞乳桿菌L8、植物乳桿菌L8、凝結(jié)芽孢桿菌B1)分別接種到糖度為10 °Bx的大米麥根培養(yǎng)基和玉米麥根培養(yǎng)基上，靜置發(fā)酵5 d，每隔24 h測定乳酸含量，并在發(fā)酵5 d后測定所產(chǎn)乳酸中L-乳酸和D-乳酸的比例[19]。從而初步確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基和高產(chǎn)L-乳酸菌株。

1.3.4.2 初始糖度對不同菌株發(fā)酵性能的影響

取能高產(chǎn)L-乳酸的菌株接種到初始糖度分別為10、12、14、16、18 °Bx最適發(fā)酵培養(yǎng)基上，靜置發(fā)酵13 d，每隔24 h測定乳酸含量，發(fā)酵13 d后測定所產(chǎn)乳酸中L-乳酸和D-乳酸的比例，從而確定高產(chǎn)L-乳酸菌株的最適初始糖度。

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 取樣預(yù)處理

每隔24 h對發(fā)酵液取樣5 mL，對發(fā)酵液進(jìn)行離心(7 000 r/min，4 ℃離心10 min)后取上清液。

1.3.5.2 乳酸總量的測定

取上清液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后于HPLC測定乳酸總量，檢測條件：Agilent 1200SL液相色譜儀，色譜柱HPX-87H(300 mm×7.8 mm×9 μm)，UV檢測器，流動相為5 mmol/L的H2SO4溶液，柱溫60 ℃，流速為0.6 mL/min，波長210 nm，保留時間12.6 min，進(jìn)樣量為 20 μL。

1.3.5.3L-乳酸和D-乳酸的測定

取上清液，按照L/D-LACTATE試劑盒說明書，對發(fā)酵液中的L-乳酸和D-乳酸含量進(jìn)行測定。

1.3.5.4L-乳酸、D-乳酸光學(xué)純度的計算

按照1.3.5.3的方法分別測定乳酸菌發(fā)酵液中L-乳酸和D-乳酸的生成量，L-乳酸、D-乳酸的光學(xué)純度計算如公式(1)、(2)所示：

(1)

(2)

式中：A1為L-乳酸產(chǎn)量；A2為D-乳酸產(chǎn)量。

1.3.5.5 乳酸乙酯酯合成量的測定

吸取1 g乳酸和20 mL無水乙醇于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)入250 mL玻璃瓶中，加5 g烘干曲粉，調(diào)pH值為3.5，于30 ℃保溫酯化7 d。然后加入50 mL蒸餾水于1 000 mL蒸餾燒瓶中加熱蒸餾，并接收餾出液100 mL。取酯化餾出液進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜檢測條件：色譜柱Agilent HP-INNOWAX (30 m×320 μm×0.25 μm)；載氣為高純氮氣(>99.999 %)；柱流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測器溫度200 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；進(jìn)樣體積為1 μL；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同構(gòu)型乳酸對黑曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的影響

通過將實驗室篩選得到高產(chǎn)乳酸乙酯酯化酶菌株黑曲霉T103對不同構(gòu)型(L/D)乳酸底物進(jìn)行乳酸乙酯酯合成量的測定，結(jié)果如表1所示。

表1 不同比例L/D-乳酸對黑曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響Table 1 Effects of different ratios of L/D-Lactic acid on synthesis of ethyl lactate by Aspergillus niger esterase

注：酶作用酯合成量=綜合作用酯合成量-化學(xué)作用酯合成量，其中不加曲為化學(xué)作用，加曲為綜合作用。

由表1可知,以不同比例L-乳酸，D-乳酸為底物，黑曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的量有很大不同，當(dāng)?shù)孜餅?00 %L-乳酸時，黑曲酯化酶酯化合成乳酸乙酯的量最高，達(dá)到1 546.21 mg/L,當(dāng)?shù)孜餅?00 %D-乳酸時，黑曲酯化酶合成乳酸乙酯的量較低，僅有321.49 mg/L,當(dāng)L-乳酸所占比例增加時，黑曲酯化酶合成乳酸乙酯的量隨之增加，并且由表中數(shù)據(jù)可初步判斷L-乳酸和D-乳酸并不存在競爭性抑制，黑曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的量與L-乳酸、D-乳酸所占比例基本成對應(yīng)關(guān)系。說明黑曲酯化酶對L-乳酸的酯化能力更強(qiáng)，而對D-乳酸的酯化能力較弱，這可能與L-乳酸和D-乳酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，由于L-乳酸和D-乳酸互為旋光異構(gòu)體，而且脂肪酶催化乳酸與乙醇的酯化反應(yīng)為乒乓機(jī)制[20]，因此根據(jù)誘導(dǎo)契合學(xué)說，推測有兩種可能，一是相較于D-乳酸，L-乳酸對黑曲酯化酶的誘導(dǎo)性較強(qiáng)，其活性中心與L-乳酸更易形成穩(wěn)定的中間復(fù)合物，并與乙醇結(jié)合后生成乳酸乙酯，二是相較于L-乳酸，黑曲酯化酶與D-乳酸形成中間復(fù)合物后，修飾變構(gòu)后的中間絡(luò)合物穩(wěn)定性較差不能與乙醇進(jìn)行充分地結(jié)合接觸，從而導(dǎo)致黑曲酯化酶對D-乳酸的催化效果相較于L-乳酸較低。

2.2 高產(chǎn)L-乳酸發(fā)酵工藝的研究

2.2.1 不同菌株在兩種原料(大米、玉米)發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵性能的比較

2.2.1.1 不同菌株在兩種原料(大米、玉米)發(fā)酵培養(yǎng)基上產(chǎn)酸量的比較

將7株乳酸菌按照1.3.2的方法接種到兩種不同原料的發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵5 d，乳酸產(chǎn)量的變化趨勢如圖1、圖2所示。

圖1 不同菌株在大米發(fā)酵培養(yǎng)基上的乳酸產(chǎn)量Fig.1 Lactic acid production of various strainson rice fermentation medium

圖2 不同菌株在玉米發(fā)酵培養(yǎng)基上的乳酸產(chǎn)量Fig.2 Lactic acid production of various strains on corn fermentation medium

由圖1、圖2可知，通過乳酸產(chǎn)量的變化，我們發(fā)現(xiàn)各乳酸菌在不同原料的發(fā)酵培養(yǎng)基上的發(fā)酵性能具有很大差別。其中乳酸片球菌P1，保加利亞乳桿菌L5，戊糖片球菌P5三株乳酸菌發(fā)酵5 d時乳酸產(chǎn)量較低，均低于30 g/L,而另外4株乳酸菌(凝結(jié)芽孢桿菌B1、干酪乳桿菌L1、短乳桿菌L3、植物乳桿菌L8)均有較高乳酸產(chǎn)量，其中凝結(jié)芽孢桿菌B1和干酪乳桿菌L1的產(chǎn)酸量最高，發(fā)酵5 d能達(dá)到63.15 g/L,這說明凝結(jié)芽孢桿菌B1和干酪乳桿菌L1相較于其他乳酸菌具有更高的發(fā)酵速度，若繼續(xù)延長時間，發(fā)酵能進(jìn)行徹底。而通過比較2種原料(玉米、大米)的乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)各乳酸菌在以大米為原料的發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵時的乳酸產(chǎn)量略高于以玉米為原料的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酸量，但差別并不大。

2.2.1.2 不同菌株在2種原料(玉米、大米)的發(fā)酵培養(yǎng)基上產(chǎn)L/D-乳酸比例的比較

將7株乳酸菌按照1.3.2的方法接種到兩種不同原料的發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵5 d，產(chǎn)L-乳酸、D-乳酸比例如表2、表3所示。

表2 不同菌在大米發(fā)酵培養(yǎng)上產(chǎn)L/D-乳酸的比例Table 2 Proportion of L/D-lactic acid produced by various strain on rice fermentation medium

表3 不同菌在玉米發(fā)酵培養(yǎng)基上產(chǎn)L/D-乳酸的比例

由表2可知，各菌株在以大米乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵5 d，對發(fā)酵液進(jìn)行L-乳酸、D-乳酸的測定，各菌株都能產(chǎn)L-乳酸和D-乳酸，并以產(chǎn)L-乳酸為主，D-乳酸所占比例較小，眾所周知，大多數(shù)乳酸菌中同時存在著D-LDH和L-LDH，由于ldhD和ldhL基因表達(dá)水平的不同，從而合成相應(yīng)構(gòu)型的乳酸。而在這7種乳酸菌中其中以凝結(jié)芽孢桿菌B1和干酪乳桿菌L1所產(chǎn)L-乳酸比例較高，均達(dá)到80 %以上，這與產(chǎn)L-乳酸菌種類型的相關(guān)報道相符。通過對比表3，各菌株在以玉米乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵，相較于在大米培養(yǎng)基上發(fā)酵，我們發(fā)現(xiàn)各菌株還是以產(chǎn)L-乳酸為主，但產(chǎn)L-乳酸的比例均有增加，其中凝結(jié)芽孢桿菌B1產(chǎn)L-乳酸所占比例最高，達(dá)到了99.61 %，其次為干酪乳桿菌L1產(chǎn)L-乳酸比例為86.78 %，這可能與大米和玉米的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，不同的營養(yǎng)物質(zhì)對L-LDH和D-LDH的活力有影響，從而對ldhD和ldhL的基因表達(dá)量產(chǎn)生影響。綜上結(jié)合產(chǎn)乳酸總量和L-乳酸所占比例，我們初步選擇凝結(jié)芽孢桿菌B1和干酪乳桿菌L1為高產(chǎn)L-乳酸菌株，以玉米乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸發(fā)酵，以供后續(xù)實驗。

2.2.2 初始糖度對菌株發(fā)酵性能的影響

2.2.2.1 初始糖度對菌株產(chǎn)酸能力的影響

將凝結(jié)芽孢桿菌B1和干酪乳桿菌L1按照1.3.2的方法接種于不同初始糖度的以玉米為原料的乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵13 d，乳酸產(chǎn)量的變化趨勢如圖3、圖4所示。

圖3 初始糖度對干酪乳桿菌L1產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of different initial sugar content on acid yield of Lactobacillus casei L1

圖4 初始糖度對凝結(jié)芽孢桿菌B1產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of different initial sugar content on acid production of Bacillus coagulans B1

由圖3、圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，產(chǎn)乳酸的速率逐漸減小，并且隨著初始糖度的增加，發(fā)酵速率也逐漸較小，干酪乳桿菌L1與凝結(jié)芽孢桿菌B1相比，干酪乳桿菌L1的發(fā)酵速率較低，隨著初始糖度的增加，凝結(jié)芽孢桿菌B1的產(chǎn)酸量隨之增加，在初始糖度18 °Bx的發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵13 d產(chǎn)酸量達(dá)到89.19 g/L,但發(fā)酵速率也隨之減弱，可見在乳酸產(chǎn)量上，凝結(jié)芽孢桿菌B1相較于干酪乳桿菌L1具有更高的發(fā)酵能力。

2.2.2.2 初始糖度對菌株產(chǎn)不同構(gòu)型乳酸的影響

將干酪乳桿菌L1和凝結(jié)芽孢桿菌B1按照1.3.2的方法接種于以玉米為原料的發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵13 d，產(chǎn)L-乳酸和D-乳酸比例如表4、表5所示。

表4 初始糖度對干酪乳桿菌L1產(chǎn)L/D-乳酸比例的影響Table 4 Effect of different initial sugar content on the ratio of L/D-lactic acid produced by Lactobacillus casei L1

表5 初始糖度對凝結(jié)芽孢桿菌B1產(chǎn)L/D-乳酸比例的影響Table 5 Effects of different initial sugar content on the ratioof L/D-lactic acid produced by Bacillus coagulans B1

由表4、表5可知，隨著初始糖度的增加，干酪乳桿菌L1和凝結(jié)芽孢桿菌B1所產(chǎn)乳酸中L-乳酸所占比例基本一致，均以產(chǎn)L-乳酸為主，其中干酪乳桿菌L1所產(chǎn)L-乳酸的比例穩(wěn)定在85 %左右，而凝結(jié)芽孢桿菌B1產(chǎn)L-乳酸的比例穩(wěn)定在99 %，說明初始糖度的變化對產(chǎn)L-乳酸的比例沒有明顯影響。

2.2.3 高產(chǎn)L-乳酸工藝的初步確定

通過對7株乳酸菌發(fā)酵性能和產(chǎn)L-乳酸比例的比較，初步確定最佳工藝為：篩選得到凝結(jié)芽孢桿菌B1接種于糖度為18 °Bx的玉米乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置發(fā)酵13 d，乳酸總量可達(dá)89.19 g/L,其中L-乳酸所占比例高達(dá)99 %。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)相較于D-乳酸，黑曲酯化酶對L-乳酸具有更強(qiáng)的酯化能力，通過對7株乳酸菌在不同原料，不同初始糖度的發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵性能的比較，發(fā)現(xiàn)各菌株在玉米發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵所產(chǎn)L-乳酸比例明顯高于大米發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不同初始糖度對產(chǎn)L-乳酸的比例沒有明顯影響，并初步確定了白酒用產(chǎn)L-乳酸工藝：以凝結(jié)芽孢桿菌B1為出發(fā)菌株，接種于糖度為18 °Bx的玉米乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置發(fā)酵13 d，乳酸總量可達(dá)89.19 g/L,其中L-乳酸所占比例高達(dá)99 %。為今后乳酸菌的強(qiáng)化發(fā)酵和高乳酸乙酯調(diào)味酒的制備奠定了基礎(chǔ)。