邱小燕，奚愷鋒，謝新輝，田玉橋，伍賢進，曾軍英，邵濤，姚元枝*

1(懷化學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，湖南 懷化，418008)2(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙，410123)3(民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化，418008)4(湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點實驗室,湖南 懷化，418008)5(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 飼草調(diào)制加工與貯藏研究所，江蘇 南京，210095)

近年來，飼料短缺已成為制約畜牧產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展的重要因素。發(fā)酵全混合日糧(total mixed ration, TMR)是指TMR在厭氧環(huán)境下經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵，最終配制成營養(yǎng)相對平衡的日糧[1]。近年來，發(fā)酵TMR已被廣泛用于奶牛的飼喂，而且將農(nóng)副產(chǎn)品及食品副產(chǎn)物調(diào)制成發(fā)酵TMR的趨勢也在逐漸增加[2-3]。TMR經(jīng)過發(fā)酵能產(chǎn)生特別的酸香味，提高奶牛的食欲，有利于奶牛的生長和發(fā)育。丁良等[4]用不同比例筍殼逐步替代全株玉米調(diào)制成發(fā)酵TMR，25%替代組不僅有良好的發(fā)酵品質(zhì)而且有氧穩(wěn)定性高。WANG等[5-6]將蘑菇渣、綠茶渣等農(nóng)副產(chǎn)物調(diào)制成發(fā)酵TMR，獲得了品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)均衡的全價飼料。WEINBERG等[7]將含有玉米酒糟的發(fā)酵TMR保存140 d后，其發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性均良好。SRITA等[8]用40%的土豆渣和豆腐渣替代精料調(diào)配成發(fā)酵全混合日糧，發(fā)酵品質(zhì)較好，且采食率沒有顯著變化。王勇等[9]以全株玉米和青稞秸稈為主要粗飼料的TMR配方基礎(chǔ)上，用苜蓿、全株燕麥和小麥秸稈按不同比例替代全株玉米，30%全株玉米替代組可應(yīng)用于生產(chǎn)實際。因此，推廣發(fā)酵TMR技術(shù)已成為促進農(nóng)區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的重要措施。

四棱豆(PsophocarpustetragonolobusL.)為菜豆族四棱豆屬的栽培種，是一種攀援類植物，高度一般在3～4 m。四棱豆不僅蛋白質(zhì)含量高，且富含必需氨基酸[10]，但四棱豆種植面積較少，作為飼料的精糧成本頗高。中國是農(nóng)作物秸稈產(chǎn)出大國，年總量達5.2×108t以上[11]，大量秸稈隨地堆棄和任意焚燒對環(huán)境造成嚴重污染[12]。因此，秸稈飼料化已成為促進農(nóng)區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的重要措施，不僅可以減少資源的浪費和環(huán)境的污染[13]，還能帶動畜牧經(jīng)濟的增長。但是秸稈質(zhì)地粗糙、適口性差，干物質(zhì)和粗纖維含量高，且可溶性碳水化合物含量低，自然附著的乳酸菌數(shù)量少[14]，所以常規(guī)青貯很難調(diào)制出高品質(zhì)的青貯飼料。若能用秸稈代替部分四棱豆制成發(fā)酵TMR，不僅可以彌補秸稈蛋白質(zhì)含量不足、適口性差的缺陷，也能降低飼料成本?？梢?，若將秸稈替代四棱豆，調(diào)配成發(fā)酵TMR，既可以解決優(yōu)質(zhì)飼料資源受限的問題，又能充分利用農(nóng)副產(chǎn)品，變廢為寶。

本試驗以水稻秸稈、玉米秸稈、全株四棱豆、精料為原料調(diào)配成不同比例混合的發(fā)酵TMR，研究不同秸稈替代水平對TMR發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響，旨在篩選出品質(zhì)較好的發(fā)酵TMR，為農(nóng)區(qū)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵TMR提供技術(shù)支撐，促進畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

如表1所示，TMR由水稻秸稈、全株四棱豆、玉米秸稈和精料構(gòu)成。四棱豆處于結(jié)莢期，水稻秸稈和玉米秸稈分別為水稻和玉米去除籽實后的秸稈，精料由玉米粉、豆粕、菜粕、棉粕、酒糟蛋白飼料(distillers dried grains with solubles, DDGS)、麥麩、預(yù)混料和食鹽以適當?shù)谋壤旌隙桑衩追?、豆粕、菜粕、棉粕、麥麩、DDGS從飼料市場采購。

表1 TMR原材料營養(yǎng)成分Table 1 Chemical composition of original material of TMR

注:FW: fresh weight，鮮重; DM:dry matter，干重；精料：質(zhì)量分數(shù)30%玉米粉，4%豆粕，12%菜粕，8%棉粕，15%DDGS，20%麥麩，9%預(yù)混料，2%食鹽(DM)。

1.2 實驗設(shè)計

秸稈按照設(shè)定比例逐步替代全株四棱豆，與精料調(diào)配成發(fā)酵TMR，其中秸稈所占TMR的質(zhì)量分數(shù)依次為10%(A)、20%(B)、30%(C)、40%(D)，如表2所示。對每個處理進行營養(yǎng)特性、發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的研究，共4個處理，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。發(fā)酵35 d后打開青貯袋，分別在第0、3、6、9、12、15天測定有氧穩(wěn)定性，并測定相應(yīng)指標變化。

表2 TMR的組成 單位：%DM(質(zhì)量分數(shù))

1.3 發(fā)酵TMR調(diào)制

將水稻秸稈、玉米秸稈和全株四棱豆用鍘刀切割至1～2 cm，并按照設(shè)定的配方配比混合均勻，裝入8 kg TMR于青貯袋中，同一個處理5個重復(fù)，抽真空發(fā)酵。

1.4 樣品預(yù)處理

在預(yù)定的青貯發(fā)酵天數(shù)打開青貯袋，取出發(fā)酵TMR并混勻，樣品分為3份，一份用于浸提，得到的浸提液置于-20 ℃冰柜中保存待測；一份樣品烘干粉碎保存待測；一份用于微生物計數(shù)。

1.5 感官評分

青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)評定選用V-Score[15]評價體系，以青貯飼料中所含的氨態(tài)氮/總氮(NH3-N/TN)和揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量來評定發(fā)酵品質(zhì)的優(yōu)劣，并將各項得分相加獲得最終評價分數(shù)，根據(jù)這個評價體系，將青貯飼料品質(zhì)分為滿分(100分)、良好(>80分)、中(60～80分)、差(<60分)4個等級，具體評分標準見表3。

表3 青貯飼料V-Score評分體系Table 3 V-Score evaluation for silage

注：NH3-N:氨態(tài)氮；TN:總氮。下同。

1.6 測定指標及方法

干物質(zhì)采用65 ℃，48 h干燥法測定[16]；pH值用雷諾精密pH計測定；乳酸和揮發(fā)性脂肪酸采用GC-2014氣相色譜儀測定；粗蛋白采用凱氏定氮法測定[17]；氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[18]；水溶性碳水化合物含量采用硫酸-蒽酮比色法測定[18]；粗脂肪含量采用殘余法測定[16]；粗灰分采用灼燒法測定[16]；乳酸菌采用瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、好氧性細菌采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，乳酸菌在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)2～3 d；好氧性細菌和酵母菌用生化培養(yǎng)箱37 ℃分別培養(yǎng)1～3 d，計數(shù)。

1.7 有氧穩(wěn)定性測定

青貯35 d后，進行有氧穩(wěn)定性測定，青貯袋打開后，放置于25 ℃恒溫室內(nèi)，用ZDR溫濕度記錄儀測定青貯飼料中心處溫度，利用熱點偶原理，每30 min自動記錄青貯飼料中心處的溫度[19]，同時相應(yīng)的取樣測定青貯飼料的pH值，乳酸碳水化合物、乙酸、丙酸、丁酸含量及微生物數(shù)量的變化。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

試驗數(shù)據(jù)先用Excel軟件處理，再用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMR營養(yǎng)及微生物成分

如表1所示，水稻秸稈及玉米秸稈的粗蛋白及水溶性碳水化合物含量都較低，粗灰分含量較高，四棱豆的粗蛋白含量較高。發(fā)酵前不同TMR組的營養(yǎng)及微生物成分如表4所示，隨著秸稈替代水平的增加，發(fā)酵TMR的干物質(zhì)和粗蛋白含量呈下降的趨勢，水溶性碳水化合物含量則顯著(P<0.05)降低。各組粗脂肪和粗灰分含量無顯著性差異。各組乳酸菌(>4.0 lg CFU/g FW)和好氧性細菌數(shù)量無顯著性差異，C組的酵母菌數(shù)量顯著(P<0.05)高于A組和B組，其他3組酵母菌數(shù)量沒有顯著性(P>0.05)差異。

表4 TMR的營養(yǎng)和微生物成分Table 4 The chemical and microorganism composition of TMR

2.2 TMR的發(fā)酵品質(zhì)

各組TMR的V-Score評分結(jié)果如圖1所示，C和D組的品質(zhì)得分顯著(P<0.05)高于A組，B組與其他3組間品質(zhì)得分無顯著性差異(P>0.05)。由表5可知，發(fā)酵35 d以后，C和D組的pH值顯著(P<0.05)低于B和A組，相應(yīng)的C和D組的乳酸含量顯著(P<0.05)高于B和A組。4組的乙酸、丙酸和丁酸含量都較低，A組的氨態(tài)氮/總氮顯著(P<0.05)高于各替代組，B和D組氨態(tài)氮/總氮顯著(P<0.05)低于C組，D組的水溶性碳水化合物含量最高，顯著(P<0.05)高于B和C組。

圖1 不同處理對TMR發(fā)酵品質(zhì)得分的影響Fig 1 Effects of different treatment on the fermentation quality score of TMR

表5 青貯35 d后TMR發(fā)酵品質(zhì)Table 5 The fermentation quality of TMR after 35 days of fermentation

注：不同小寫字母表示不同處理組間的差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 有氧暴露階段發(fā)酵TMR pH值、乳酸、水溶性碳水化合物、乙酸、丙酸和丁酸含量的變化

不同替代比例的TMR有氧穩(wěn)定性如圖2所示。D組的有氧穩(wěn)定性顯著(P<0.05)高于A和C組，與B組無顯著(P>0.05)性差異，達到360 h，A組有氧穩(wěn)定性最低。

圖2 青貯35 d后不同處理對TMR有氧穩(wěn)定性的影響Fig 2 Effect of different treatment on the aerobic stability of TMR after 35 d of ensiling

如表6所示，B和D組pH值在整個有氧暴露過程中沒有明顯的變化，A組和C組的pH值在有氧暴露第9天顯著(P<0.05)上升，顯著(P<0.05)高于B和D組。在TMR發(fā)酵產(chǎn)酸方面，A、C和D組乳酸含量在有氧暴露第15天顯著(P<0.05)下降到最低值，B組乳酸含量呈下降的趨勢(P>0.05)，有氧暴露9 d后，A組的乳酸含量在整個有氧暴露階段均低于其他各組。A和C組水溶性碳水化合物含量在有氧暴露第9天均顯著(P<0.05)下降，D組在第12天顯著(P<0.05)下降，B組呈下降(P>0.05)的趨勢，D組水溶性碳水化合物含量在整個有氧暴露階段均高于其他3組。各組間乙酸含量都呈先下降后上升的變化趨勢，其中A組乙酸產(chǎn)量最少，在有氧暴露第9 d后B組乙酸含量顯著(P<0.05)高于其他3組；只有D組的丙酸含量呈先上升后下降的趨勢，其他組均為下降的變化趨勢；A組和B組丁酸含量在整個有氧暴露過程中無顯著性變化(P>0.05)，D組丁酸含量在有氧暴露第15天顯著(P<0.05)上升，并顯著(P<0.05)高于其他3組。

表6 有氧暴露階段發(fā)酵TMR pH值、乳酸、水溶性碳水化合物、乙酸、丙酸及丁酸含量的變化Table 6 Changes of pH value, lactic acid, water soluble carbohydrate, acetic acid, propionic acid, butyric acid contents in TMR during aerobic exposure stage

注：不同大寫字母表示相同有氧暴露時間不同處理組間的差異顯著(P<0.05)。下同。

2.4 有氧暴露階段發(fā)酵TMR微生物數(shù)量的變化

如表7所示，各組的好氧性微生物數(shù)量隨著有氧暴露時間的增加均呈上升的變化趨勢，在有氧暴露第15天各組好氧性微生物數(shù)量最高，其中C組好氧性微生物數(shù)量在有氧暴露第0天顯著(P<0.05)低于A組，D組在有氧暴露第12天顯著(P<0.05)高于其他3組。各組酵母菌的數(shù)量隨著有氧暴露天數(shù)的延長均呈先上升后下降的趨勢，其中B組在有氧暴露第0天及第12天分別顯著(P<0.05)低于C組及A組。在剛拆袋(0 d)打破厭氧環(huán)境時，各組乳酸菌數(shù)量均處于較高水平(>6 lg CFU/g)。除D組呈先上升再下降的趨勢外，其他3組乳酸菌數(shù)量隨著有氧暴露天數(shù)的延長一直下降。

3 討論

青貯是指水溶性碳水化合物被乳酸菌利用，代謝產(chǎn)生有機酸(主要是乳酸)降低pH值，從而抑制有害微生物活性使飼料能夠長期貯藏[20]。因此，pH成為判斷青貯后青貯飼料品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標，水溶性碳水化合物含量及乳酸菌數(shù)量成為影響青貯品質(zhì)的重要因素。一般認為，青貯原料的乳酸菌數(shù)量達到5 lg CFU/g FW，水溶性碳水化合物含量超過25～35 g/kg DM，才能獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料[21]。許能祥等[22]通過添加米糠以補充稻草中可溶性碳水化合物的不足，增加發(fā)酵底物，獲得品質(zhì)較好的混合青貯飼料。本試驗各組TMR原料水溶性化合物含量均在45 g/kg DM以上，乳酸菌數(shù)量均接近5 lg CFU/g FW，各組TMR發(fā)酵品質(zhì)均屬良好，也可以從較低的pH、丁酸和氨態(tài)氮的含量得以體現(xiàn)，丁酸和氨態(tài)氮濃度的高低直接反應(yīng)青貯過程中腐敗菌的活動情況[23]，一般認為優(yōu)質(zhì)青貯飼料的丁酸含量和氨態(tài)氮含量應(yīng)低于10 g/kg DM和100 g/kg TN[24]，本試驗中，各組TMR氨態(tài)氮和丁酸含量都較低，表明整個青貯過程沒有發(fā)生腐敗尤其是蛋白質(zhì)的大量分解[24]，這可能與水溶性碳水化合物充足，乳酸菌數(shù)量較高，整個青貯過程快速進入乳酸發(fā)酵期，乳酸增多，pH值降低，有害微生物活性被抑制，從而保證了青貯質(zhì)量。開袋后各組TMR的pH值都要高于4.2，這可能與青貯的材料的干物質(zhì)含量較高有關(guān)，原現(xiàn)軍等[25]的研究表明青貯飼料干物質(zhì)含量較高時，pH值在4.5左右，也能使飼料良好保存。

表7 有氧暴露階段發(fā)酵TMR微生物數(shù)量變化Table 7 Changes in microbial biomass of TMR during aerobic exposure stage

有氧暴露后，厭氧環(huán)境被打破，好養(yǎng)性微生物和酵母菌大量繁殖，水溶性碳水化合物和乳酸被分解成有機酸，且釋放熱量導(dǎo)致飼料內(nèi)部溫度上升，從而加快腐敗的速度，本試驗各組TMR水溶性碳水化合物及乳酸在整個有氧暴露階段均呈下降的趨勢，其中，10%和30%替代組下降的幅度較大。TMR開袋后，直接接觸空氣，pH值的變化可以直觀地反映其腐敗速度和程度，pH值較低，蛋白質(zhì)降解可以被有效地抑制[26]。10%和30%替代組的pH值在有氧暴露9 d后，分別顯著上升至5.82和4.83，20%和40%替代組pH值在整個有氧暴露過程中沒有明顯的變化。大量研究表明酵母菌是引起青貯飼料有氧腐敗的主要微生物，HAO等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Zygosaccharomycesbailii數(shù)量的增加會引起TMR在有氧暴露期間有氧變質(zhì)，CARVAIHO等[28]研究表明，Candida、Schizosaccharomycespombe和Zygosaccharomycesbailii，是降低青貯飼料有氧穩(wěn)定性的主要微生物。本試驗10%替代組的酵母菌數(shù)量在有氧暴露第12天顯著上升，這表明10%替代組和30%替代組在有氧暴露第9天開始腐敗，這可能與20%和40%替代組的乙酸含量較高有關(guān)，乙酸是一種主要揮發(fā)性脂肪酸，含量多少反映醋酸菌的活動情況，乙酸含量是預(yù)測發(fā)酵TMR有氧穩(wěn)定優(yōu)劣的重要指標，乙酸的解離程度低，會以被動運輸?shù)男问竭M入微生物細胞內(nèi)，降低其胞內(nèi)pH值，破壞細胞的酸堿平衡，從而殺死細胞，抑制酵母、好養(yǎng)性微生物的生長繁殖[29]。邱小燕等[30]在研究糖蜜和乙酸對發(fā)酵TMR品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性影響時表明乙酸濃度越高，有氧腐敗的時間會相應(yīng)的延長。SCHMIDT等[29]的研究亦表明，乙酸含量越高，青貯飼料有氧腐敗的時間相應(yīng)延長。

4 結(jié)論

綜上所述，30%和40%替代組發(fā)酵35 d后顯示良好的發(fā)酵品質(zhì)，pH值較低(4.2左右)，乳酸含量較高，氨態(tài)氮/總氮值低于對照組，但30%替代組的有氧穩(wěn)定性較低，而40%的有氧穩(wěn)定性較高，同時從秸稈最大化利用角度出發(fā)，用40%的秸稈替代發(fā)酵TMR中四棱豆最為適宜。本研究中發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性并沒有隨著秸稈替代比例的升高而降低，40%替代組仍保持了較高的有氧穩(wěn)定性的機理還有待進一步研究。