吳卓凡，圣弟青，王金晶，鈕成拓，劉春鳳，鄭飛云，李崎*

1(江南大學，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

枇杷(Loquat)別名蘆橘、金丸等，屬薔薇科植物，原產(chǎn)地為長江下游，后來傳至全國各地，因其葉子形狀神似樂器琵琶而得名枇杷，其花、果、葉均可入藥。枇杷是一種季節(jié)性水果，應季的時候產(chǎn)量較大，且不耐儲存和運輸[1]。結果季節(jié)會有一定量的滯銷鮮果或品相較差的果子，枇杷階段性的產(chǎn)能過剩會對果農(nóng)會造成一定量的經(jīng)濟利益損失[2]。市場上暫無純種發(fā)酵枇杷果酒銷售，其余品類的枇杷果酒亦較少，由于枇杷的食藥特性[3]受到消費者的青睞，枇杷果酒銷量可期。枇杷果酒作為一種可商業(yè)化的果酒，暫無專用菌株。

市售的發(fā)酵枇杷果酒較少，僅有浙江、四川2個枇杷產(chǎn)地有少量傳統(tǒng)方法發(fā)酵的枇杷果酒，而且皆采用自然發(fā)酵，酒精度及發(fā)酵度較低，工藝耗時數(shù)月，產(chǎn)量較低。枇杷果酒市值相對于其他成熟果酒市場而言較小，但是枇杷的食藥用價值較高，枇杷果酒的市場潛力較大。優(yōu)良菌株對果酒發(fā)酵產(chǎn)品的影響至關重要[4]：菌株起酵快、發(fā)酵能力強，就意味著枇杷果酒的生產(chǎn)周期短、設備利用率高、單位生產(chǎn)成本低、固定產(chǎn)量設備及人工需求量低；菌株性能穩(wěn)定及風味物質(zhì)佳，就意味著產(chǎn)品穩(wěn)定性好、易受消費者喜愛。所以枇杷果酒在目前缺少專用菌株以及純種發(fā)酵技術的情況下，亟需1株能生產(chǎn)高品質(zhì)的枇杷果酒的釀酒酵母[5]。

本實驗利用生物技術，從自然界分離篩選得到1株在枇杷果汁內(nèi)起酵快、發(fā)酵強、風味佳的枇杷果酒專用酵母，并對其進行了菌種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷果汁，綠源果汁公司；瓊脂粉、胰-蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、卡那霉素和TTC等，國藥試劑；酵母基因組提取試劑盒，TIANGEN生物科技有限公司；蔗糖(98%純度)食品級，市售。

1.2 儀器與設備

雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；電子天平，Ohaus公司；紫外-可見分光光度計，上海天美公司；恒溫搖床，強樂實驗設備公司；移液器，德國Eppendorf公司；Hve-50全自動高壓蒸汽滅菌鍋，日本平山制作所株式會社；高速離心機，美國Thermo Scientific公司；R5408冷凍離心機，德國Eppendorf公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國Thermo Scientific公司。

1.3 培養(yǎng)基與菌種

枇杷汁富集培養(yǎng)基(g/L)：枇杷汁，蔗糖 142，滅菌冷卻后加入氨芐青霉素 1。YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖20。斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂粉20。TTC平板培養(yǎng)基下層(g/L)：葡萄糖50，蛋白胨20，酵母浸膏15，酸性磷酸鉀10，MgSO44，檸檬酸0.27，瓊脂20，氨芐青霉素1。TTC平板培養(yǎng)基上層(g/L)：葡萄糖5，瓊脂15，滅菌冷卻后加入TTC 0.5。

菌種：法國釀酒酵母D254作為對照。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種分離與TTC篩選

將新鮮成熟的白玉枇杷果榨汁，調(diào)整糖度為22 °Bx，放入已滅菌的500 mL燒杯中，于室外自然環(huán)境(環(huán)境溫度20～30℃)中敞口自然發(fā)酵[6]，待燒杯中有較多氣泡產(chǎn)生且有酒香味時，取5 mL發(fā)酵醪液接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基。另外將枇杷果皮和果園土壤分別放入帶玻璃珠與無菌水的三角瓶中打漿[7]，適度稀釋后取5 mL懸液接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)24 h。

用TTC下層培養(yǎng)基制備平板，待平板冷卻后進行涂布分離。將培養(yǎng)好的菌液稀釋成原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共6個梯度，每個梯度3個平行，28 ℃靜置培養(yǎng)2 d，等到菌落直徑>2 mm后進行下一步實驗。配制TTC上層固體培養(yǎng)液(注意TTC試劑的避光和避高溫)，將TTC上層平板倒入，避光倒置2 h后觀察。典型的釀酒酵母菌落表面有光澤、柔軟粘濕、易挑取[8]，其中有產(chǎn)酒精能力的釀酒酵母在TTC平板上顯紅色[9]。據(jù)此特征從TTC平板上選取有典型釀酒酵母形態(tài)并且顯示紅色的菌落，將所有單個的菌落挑取一環(huán)于10 mL YPD培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)24 h。若兩個菌落接合生長，則使用YPD固體平板進行劃線分離，直到出現(xiàn)單菌落。以上菌種經(jīng)過培養(yǎng)后都使用斜面進行臨時保藏。

1.4.2 菌種復篩

將YPD試管內(nèi)28℃培養(yǎng)24 h后的酵母以8%的接種量接入枇杷汁杜氏小管中(SO2質(zhì)量濃度250 mg/L)[10]，使用杜氏小管發(fā)酵法25℃靜置培養(yǎng)，接種8 h后，每隔2 h觀察各菌株的產(chǎn)氣速度和產(chǎn)氣量。記錄菌株的起酵時間、產(chǎn)氣速度與靜置3 d后的發(fā)酵氣味。

1.4.3 菌種的三級篩選

1.4.3.1 枇杷果酒發(fā)酵指標測定

將杜氏小管篩選獲取的發(fā)酵能力強、起酵速度快且發(fā)酵氣味宜人的菌種進行小瓶發(fā)酵實驗。菌株活化后將菌液低溫離心并去上清，使用PBS緩沖液清洗2～3次后將酵母泥用枇杷果汁重懸浮，并按5%接種量接入糖度調(diào)整為22 °Bx的枇杷汁中，25℃發(fā)酵7 d，每日記錄失重并搖起絮凝的酵母。主酵結束測定每瓶發(fā)酵液的酒精度、殘?zhí)荹10]，并對其進行GC-MS風味物質(zhì)半定量分析與感官品評。

1.4.3.2 感官品評

組織品評小組6人(均具有相關專業(yè)知識與背景)對枇杷果酒進行感官品評[11]，總分取平均值為菌株感官品評得分。主要從外觀、香氣、風味和典型性4個方面評價，根據(jù)表1評分標準得出枇杷果酒感官品評結果。

表1 枇杷果酒感官品評評價表(總分100分)Table 1 Sensory evaluation standard of loquat wine

1.4.3.3 GC-MS風味物質(zhì)半定量分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析枇杷果酒的香氣成分[12-13]。檢測時將酒樣經(jīng)過1∶1稀釋(因為高濃度的乙醇會抑制其他揮發(fā)性物質(zhì))。樣品配置：在20 mL容量的頂空瓶中，加入4 mL枇杷果酒樣品，4 mL去離子水，50 μg/L 2-辛醇內(nèi)標，3.0 g NaCl固體。樣品前處理條件：在45℃下加熱5 min，共進行萃取60 min。等到萃取全部結束后，將頭插入樣品進口，進行5 min的解除吸附操作，然后進行GC-MS分析。風味物質(zhì)以2-辛醇作為參比計算含量。

1.4.4 菌種鑒定

以1%的接種量取-80℃甘油管保藏的菌液接種于液體YPD培養(yǎng)基中活化，使用28℃搖床培養(yǎng)24 h。取2 OD培養(yǎng)液高速離心60 s，遺棄上層清液，獲得一定的菌體，用試劑盒提取目的酵母基因組DNA。使用引物ITS-1以及ITS-2擴增目的酵母的基因組DNA[14]，得到的PCR產(chǎn)物進行核酸電泳檢測。若條帶大小合適，則產(chǎn)物寄送至蘇州Genewiz公司進行sanger測序。采用MEGA7.4軟件將測定的18S rDNA序列與GenBank中酵母菌的序列進行比對，下載匹配度前10位的序列與待鑒定菌株構建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 TTC平板初篩

通過TTC平板分離篩選后，涂布濃度為10-5的平板上約有40個單菌落，覆蓋TTC上層平板2 h后約70%的酵母菌落有顯紅色，如圖1所示。其中對照菌株D254在TTC平板上顯色較好。將有產(chǎn)酒精能力的菌株全部用斜面臨時保藏，儲存于-4℃冰箱。

圖1 TTC初篩平板Fig.1 TTC chromogenic media注：產(chǎn)酒精的菌株菌落顏色顯紅色，白色為不產(chǎn)酒精的菌株。

從枇杷果汁自然發(fā)酵液中篩選出70株的釀酒酵母，編號PP-1～PP-70。從枇杷果皮中篩選出59株的釀酒酵母，編號GP-1～GP-59。從果園土壤中篩選出80株的釀酒酵母，編號T-1～T-80?？梢娮匀唤缰杏写罅窟m合在枇杷果汁中生長的釀酒酵母，而且種類較多。

分離篩選中使用TTC平板可以大量減少進入篩選階段的菌株，剔除不產(chǎn)酒精的酵母，減少杜氏小管發(fā)酵階段30%的工作量，在企業(yè)和研究機構選育優(yōu)良菌株時有重要意義。

2.2 菌株的復篩

復篩目的是從209株菌中篩選出發(fā)酵能力合格且氣味合格的菌株[15]，因為發(fā)酵能力差、氣味差或不耐受SO2的菌株在實際果酒生產(chǎn)發(fā)酵中毫無意義，避免下一步發(fā)酵篩選時耗費大量的時間與成本檢測無用菌株的各項指標。

將209株分離出來的釀酒酵母使用10 mL YPD試管 28 ℃活化24 h，按8%的接種量接入放置了杜氏小管的10 mL枇杷果汁試管中，于25 ℃靜置培養(yǎng)，進行杜氏小管產(chǎn)氣能力及SO2耐受性檢測，結果如表2所示。

表2 釀酒酵母杜氏小管發(fā)酵篩選結果Table 2 Results of CO2 release of the strains

注：“-”表示產(chǎn)氣量較少不足50%或有異味;“+”表示產(chǎn)氣量在50%～90%或無異味;“++”表示產(chǎn)氣量在90%～100%或有酒香味。

產(chǎn)氣最快的菌株8 h時便開始產(chǎn)氣，至8.5 h后產(chǎn)氣滿杜氏小管，而3 d后仍然有超過30株菌未能產(chǎn)氣，可見不同酵母的發(fā)酵能力差異較大，其中對照菌株D254在10 h開始產(chǎn)氣，11 h內(nèi)產(chǎn)氣滿杜氏小管，發(fā)酵風味較好，無異味。共有15株酵母在12 h內(nèi)產(chǎn)氣量超過杜氏小管90%，但其中3株酵母在3 d時無酒香味或有異味，故復篩一共篩選獲得了12株發(fā)酵能力較好、氣味較好的酵母，其中有9株來自枇杷果汁自然發(fā)酵液，2株來自枇杷果皮，1株來自果園土壤，來源于枇杷果汁自然發(fā)酵液的菌株數(shù)量占比達75%，可見自然發(fā)酵后發(fā)酵能力強的菌株大致得到富集。

2.3 菌株的三級篩選

2.3.1 小瓶發(fā)酵及指標測定

對12株較為優(yōu)良的菌株以及對照菌株共計13株菌進行小瓶發(fā)酵實驗，25℃靜置發(fā)酵7 d后測定發(fā)酵指標。如表3所示，除PP-15、GP-5外的所有菌株酒精度均大于對照菌株D254，發(fā)酵能力較強。

表3 釀酒酵母小瓶發(fā)酵酒液指標測定Table 3 The contents of alcohol and weight loss, and residualsugar of loquat wine fermented by different strains

注：同一列中不同字母表示顯著差異(P<0.05)。下同。

酒精度作為菌株起酵速度、發(fā)酵能力、最終發(fā)酵度的判斷條件，相同發(fā)酵時間下酒精度低的菌株在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵周期較長，會導致單位時間產(chǎn)量降低，影響設備的經(jīng)濟效益。在本輪篩選中大部分菌株的相應發(fā)酵能力對比D254都較好，在7 d的發(fā)酵后均能將絕大部分的碳源轉化為酒精。經(jīng)統(tǒng)計學分析，各菌株之間的酒精度有一定差異，高至12.3%、低約8.6%，但均在發(fā)酵果酒酒精度的正常范圍內(nèi)，故本輪篩選中保留全部菌株進行下一步分析。

2.3.2 感官品評及風味物質(zhì)分析

經(jīng)過專業(yè)團隊的感官品評，去除了PP-26與PP-9共2株風味上有明顯缺陷(過酸、雙乙酰過高或有其他異味)的菌，去除了PP-15、PP-14、PP-20與PP-55共4株感官品評分數(shù)較低的菌(低于72分)，將其他菌種與D254進行GC-MS分析，將風味物質(zhì)按類別計算含量，感官品評結果與GC-MS分析結果如表4所示。

表4 GC-MS風味物質(zhì)半定量分析與感官品評結果Table 4 Concentrations of various flavors of loquat wine fermented by different yeast and sensory evaluation results

其中GP-34菌株各項揮發(fā)性物質(zhì)總含量均較高，相比D254醇類物質(zhì)高31%，酯類物質(zhì)高86%，酸類物質(zhì)高25%，酚類物質(zhì)高11%，醛酮類物質(zhì)略低于D254，經(jīng)SPSS顯著性分析，GP-34與D254的醛酮類物質(zhì)無顯著性差異?？倱]發(fā)性物質(zhì)以GP-34最高，相比D254增加45%，感官品評結果亦為最優(yōu)。

枇杷果酒內(nèi)共檢出超過70種風味物質(zhì)，將其分為醇類、酸類、酯類、酚類與醛酮類五類風味化合物，它們構成了果酒的發(fā)酵香味、枇杷的典型性香味。其中醇類與酯類物質(zhì)含量比例較高，是枇杷果酒較為重要的香味物質(zhì)[16-17]。酯類物質(zhì)具有濃郁花果香味且閾值較低，對酒體正面貢獻較大；醇類物質(zhì)主要是高級醇，在一定范圍內(nèi)展現(xiàn)為正面貢獻，含量超標則會導致“上頭”，醛酮類、酚類物質(zhì)雖然含量較少，但是也和醇類、酯類相互作用，維持酒體平衡。

對GP-34菌株與對照菌株D254的GC-MS報告進行歸納，計算出實際各種香味物質(zhì)含量，以香氣活力值(odor active valne，OAV)OAV表示香味物質(zhì)實際含量與閾值的比值，通過對比OAV>1的香味物質(zhì)，分析出枇杷果酒貢獻較大的風味物質(zhì)[18]，如表5所示。

表5 GP-34中主要風味物質(zhì)貢獻值Table 5 OAVs of odorants of different loquat wines

注：**表示在P<0.01水平上極顯著差異；*表示在P<0.05水平上顯著差異。

首先可以看出GP-34菌株各主要香氣組分OAV值均大于D254，可能是其感官品評獲得高分的原因。經(jīng)SPSS 24.0軟件作統(tǒng)計學分析，GP-34菌株與對照菌株D254發(fā)酵枇杷果酒的辛醛、壬醛、苯乙醇、辛酸乙酯、己酸乙酯的OAV值呈極顯著差異，乙酸乙酯的OAV值呈顯著差異。分析2株菌的OAV值，菌株GP-34的OAV>1的有4種酯、3種醇、3種醛，醇類和酯類占總OAV值95%以上；菌株D254相比GP-34少2種風味物質(zhì)，并且辛酸乙酯、己酸乙酯大幅減少。其中乙酸乙酯、辛酸乙酯以及異戊醇在總OAV值中的比例較高，意味著這3種物質(zhì)對酒體風味有著極大的貢獻。乙酸乙酯和異戊醇是酵母發(fā)酵帶來的風味物質(zhì)，富有濃郁的果香與谷物香，辛酸乙酯是一種長鏈酯，具有清新的水果香氣，這可能是枇杷果酒風味的重要組成部分[19]。識別出重要香味物質(zhì)成分對枇杷果酒的進一步改良意義重大，可以通過靶向篩選獲得香味更濃郁、典型的果酒菌株。綜合以上結果，GP-34菌株適合枇杷果酒的釀造，發(fā)酵能力強，風味物質(zhì)優(yōu)。

2.4 菌種鑒定

提取GP-34菌株的基因組DNA，PCR擴增后進行核酸電泳，結果如圖2所示，PCR產(chǎn)物的電泳條帶明亮、容易分辨，大小約為500 bp。

將產(chǎn)物進行Sanger基因測序，測序獲得的18S rDNA序列長約480 bp，解析序列后在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST，導入匹配度前10的酵母菌18S rDNA序列用MEGA 7.4軟件進行分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。如圖3所示，GP-34菌株與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)100%同源，說明GP-34菌株屬于釀酒酵母屬。同時，發(fā)現(xiàn)GP-34與1株標記為水果來源的釀酒酵母(序列ID：LC269108.1)具有最高的18S rDNA序列相似性(100%)，故將GP-34菌株鑒定為釀酒酵母。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳條帶Fig.2 PCR analysis of 18S rDNA

圖3 基于18S rDNA測序結果構建酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylodenetic tree of Saccharomyces cerevisiae based on 18S rDNA sequencing

3 討論

果酒加工的核心要素是原料、菌種和工藝，優(yōu)質(zhì)的專用菌株是企業(yè)的核心資產(chǎn)，使用不適用的菌株進行生產(chǎn)會造成質(zhì)量與產(chǎn)量的損失。本實驗主要進行了枇杷果酒專用酵母的篩選，目的是獲得1株發(fā)酵能力強、香氣濃郁且口感好的釀酒酵母。一級篩選高效地篩選出大量能利用枇杷果汁進行酒精發(fā)酵的酵母，二級篩選淘汰了發(fā)酵能力弱或氣味不宜人的酵母，小瓶發(fā)酵后進行感官品評與GC-MS分析獲得了1株口感柔和且風味濃郁的酵母，編號為GP-34。該菌株在22 °Bx的枇杷果汁中酒精度可達11.49%，可以耐受250 mg/L的SO2。在風味方面，GP-34的感官品評結果最優(yōu)，醇類、酯類、酸類、酚類與總揮發(fā)性物質(zhì)均高于對照商業(yè)菌株D254，重要風味化學物的OAV全面高于D254。經(jīng)過經(jīng)18S rDNA測序與系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定GP-34為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae。

專用果酒酵母篩選的意義在于獲得在相應果汁環(huán)境下發(fā)酵能力強、發(fā)酵風味好的菌株。發(fā)酵能力強的菌株可以通過定向富集、杜氏小管篩選等方法獲得，而風味優(yōu)良、口感好的菌株需要進一步的篩選。果酒的風味由70多種物質(zhì)構成，但是由于各種香味物質(zhì)會相互抑制或促進，難以使用香味物質(zhì)的含量與比例來展現(xiàn)風味的優(yōu)劣，而通過感官品評結果驗證GC-MS數(shù)據(jù)可以更直觀反映出不同菌株的風味優(yōu)劣。

枇杷果酒專用菌株的獲得有利于枇杷果酒行業(yè)的開拓，具有較強工業(yè)應用前景，為進一步的果酒研發(fā)奠定了基礎。