王婧，張雨晴，陳紅宇，劉英杰，隋曉楠

(東北農業(yè)大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱，150030)

自由基能夠破壞人體細胞，引起衰老效應和各種慢性疾病[1]。大豆蛋白酶解產物與花青素作為天然抗氧化劑均具有良好的自由基清除功效[2]。SPI氨基酸分數與動物蛋白相近，具有較高的營養(yǎng)價值，因此經常作補充劑[2]?；ㄇ嗨貙儆谔烊坏狞S酮類植物色素，是一種小分子活性物質，由于具有抗炎、抗氧化等生物活性而被廣泛應用于醫(yī)藥、保健食品領域[3]。花青素具有較強的蛋白親和性，可與蛋白質復合形成具有功能特性的復合體系[4]。

蛋白質與多酚在食品體系中存在共價、非共價2種作用形式[5]。在共價作用中堿性條件可誘導多酚羥基去質子化以得到醌，醌再與蛋白質發(fā)生親核反應[6]。非共價作用，包括蛋白與多酚間的氫鍵、π鍵、范德華力、疏水作用和離子作用[7]。

提高食品的營養(yǎng)與功能特性已逐漸成為食品研究熱點，在食品加工生產中，蛋白質等生物大分子與多酚等小分子物質能夠發(fā)生相互作用，目前已有文獻對多酚與蛋白復合物的生物活性及消化性進行研究。TANG等[8]發(fā)現牛血清白蛋白與白藜蘆醇的非共價作用能夠掩蓋白藜蘆醇的DPPH自由基清除能力。GALLO等[9]發(fā)現可可多酚與乳蛋白組分共價作用時游離多酚的含量降低，通過ABTS法測定的游離多酚抗氧化性也降低。ZHANG等[10]發(fā)現熱變性的SPI與花青素的非共價作用能夠促進SPI的消化率。STOJADINOVIC等[11]發(fā)現β-乳球蛋白與茶、咖啡和可可的多酚提取物之間的非共價作用均會抑制蛋白消化。

由于消化極為復雜，多酚與蛋白的互作類型可能影響蛋白的消化性及生物活性，而現有文獻對比共價/非共價作用中復合物消化性及生物活性的研究較少，SPI-花青素復合物的相應研究更是空白[12]。因此，本文主要研究共價/非共價SPI-花青素復合物在體外模擬消化過程中分子量分布、蛋白水解度及抗氧化性等變化，為開發(fā)高消化性、高抗氧化性的蛋白質-多酚復合類食品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI，自制；黑米花青素提取物，天之潤生物科技有限公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、胃蛋白酶(600 U/mg)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、胰液素，美國Sigma-aldrich；乙酸乙酯、正己烷、甲醇，北科化學品有限公司；鄰苯二甲醛、K2HPO4、KH2PO4、HCl、NaOH，新光化工試劑廠；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204型分析天平，梅勒特-托利多儀器有限公司；GL-25MS超速高速冷凍離心機，上海盛析儀器設備有限公司；FD5-3型冷凍干燥機，美國SIM公司；旋轉蒸發(fā)儀，上海皖寧精密科學儀器有限公司；WAT023635高效液相色譜儀，美國Waters公司；C18反向色譜柱(250 mm×4.6 mm, Sunfire)，美國Waters公司；JJ-1增力電動攪拌器，江蘇金城國勝儀器廠；PHS-25型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；恒溫水浴震蕩搖床，常州恩培儀器制造有限公司；Tecan Infinite 200 Pro酶標儀，瑞士帝肯公司；排阻色譜柱(300 mm×4.6 mm，Wilmington)，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SPI制備

參考江連洲等[13]的方法，過60目篩的大豆粉與正己烷按料液比1∶3(g∶mL)混合，進行3次脫脂后以1∶10(g∶mL)加去離子水，用NaOH(1 mol/L)調節(jié)溶液pH為8.0，攪拌2 h后于4 ℃下9 500×g離心30 min，用HCl(2 mol/L)調節(jié)上清液pH至4.5后靜置2 h，以6 500×g離心30 min得蛋白沉淀，經3次蒸餾水溶解并離心得蛋白沉淀物，蛋白沉淀溶解后調pH至中性。最后將此蛋白溶液預凍24 h(-40 ℃)凍干，即可得SPI。

1.3.2 花青素提純

參考SUI等[14]的方法，用蒸餾水溶解黑米提取物，進行減壓抽濾后取濾液通過固相萃取柱，將花青素濾液、體積分數0.01%的鹽酸、乙酸乙酯、甲醇以體積比1∶2∶2∶4依次通過固相萃取柱，得到含花青素的甲醇溶液并將其40 ℃旋轉蒸發(fā)，利用高效液相色譜法[18]測定提純后花青素純度為(91.17±0.04)%。

1.3.3 SPI-花青素復合物的樣品制備

參考NAGY等[15]方法制備SPI-花青素非共價復合物的樣品，首先將SPI溶解在pH為7.0的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)中，得到10 g/L的SPI溶液，溶解不同比例的花青素并使其質量濃度依次為0.17、0.25、0.50 g/L，最后在室溫避光隔氧條件下攪拌2 h即可制得SPI-花青素非共價復合物溶液。

參考JIA等[16]的方法制備SPI-花青素共價復合物的樣品，用pH為7.0的0.01 mol/L PBS溶液溶解SPI以得到10 g/L的SPI溶液，溶解不同比例的花青素并使其質量濃度依次為0.17、0.25、0.50 g/L，用0.5 mol/L NaOH調pH為9.0，于室溫條件下避光攪拌24 h后制得SPI-花青素共價復合物的溶液，調節(jié)最終pH為7.0。空白對照為未處理的SPI溶液。將上述SPI-花青素共價/非共價復合物的溶液放入透析袋(8～10 kDa)中48 h，8 h換水1次，透析液凍干后得到SPI-花青素共價/非共價復合物的樣品。

1.3.4 模擬胃腸消化

參考JIANG等[17]的方法，對其進行體外消化模擬。將 6組共價/非共價SPI-花青素復合物的樣品及SPI樣品分別溶于0.01 mol/L、pH 7.0的PBS溶液中得到蛋白含量為50 mg/mL的樣品溶液，等體積混合50 mL樣品溶液和含0.1 mmol/L MgCl2·6H2O，25 mmol/L NaHCO3，6.9 mmol/L KCl，0.9 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L (NH4)2CO3和47.2 mmol/L NaCl的模擬胃環(huán)境溶液(其中添加25 μL的0.3 mol/L CaCl2·2H2O，并用1 mol/L HCl調節(jié)pH為3.0)，最后加入胃蛋白酶，使其達到2 000 U/mL。水浴振蕩搖床在170 r/min、37 ℃下處理混合溶液，保持pH為3.0，2 h后用NaHCO3(0.5 mol/L)調節(jié)消化液的pH為中性，胃消化結束。

等體積混合胃消化樣品溶液(100 mL)與含38.4 mmol/L NaCl，85 mmol/L NaHCO3，0.8 mmol/L KH2PO4，6.8 mmol/L KCl和 0.33 mmol/L MgCl2·6H2O的模擬腸環(huán)境溶液(添加12.5 mL 160 mmol/L豬膽鹽和0.2 mL 0.3 mol/L的CaCl2·2H2O，再用1 mol/L NaOH調節(jié)pH至7.0)，最后添加適量胰液素，使胰蛋白酶達到100 U/mL。樣品在170 r/min，37 ℃的水浴振蕩搖床內，期間保持pH為7.0，于消化終點處0 ℃下保持30 min滅酶，以結束小腸消化。在胃腸消化180 min內，每30 min取樣并滅酶，按1.3.6方法測定蛋白水解度。將180 min胃腸消化后的消化液進行離心(20 min，10 000×g)，冷凍干燥所得上清液，得到粉末狀復合物消化產物。

1.3.5 分子量分布測定

分子量分布用體積排阻色譜法測定[13]。將復合物或復合物消化產物溶解于pH 7.0、0.01 mol/L的PBS溶液中，使其質量濃度達到1 mg/mL，過濾膜(0.45 μm)。流動相為pH 7.0、150 mmol/L PBS溶液；色譜柱為250 mm×4.6 mm，5 μm；進樣量為10 μL，流量為0.3 mL/min，柱溫為25 ℃，運行時間為30 min，檢測波長為220 nm。蛋白分子量標準線由核糖核酸酶(13.7 kDa)、雞白蛋白(44 kDa)，牛血清白蛋白(67 kDa)，VB12(1.35 kDa)，胰島素(5.5 kDa)制得。

1.3.6 結合率測定

參考孫紅波等[18]的方法，測定結合率。將共價/非共價SPI-花青素復合物再放入透析袋(8～10 kDa)并置于4 ℃的蒸餾水。取24 h后的透析液在520 nm測量吸光度以計算花青素含量。計算公式如下：

(1)

(2)

式中：總花青素量、游離花青素量、每毫克SPI結合花青素量，μg。

1.3.7 蛋白水解度的測定

參考劉英杰等[19]的方法，取適量胃腸消化中的消化物溶液溶解于0.01 mol/L，pH為7.0的PBS溶液中，控制樣品蛋白含量10 mg/mL。絲氨酸標準液：取絲氨酸標準品50 mg溶解于0.01 mol/L，pH為7.0的PBS溶液中，得到0.952 meqv/L的標準液。分別混合樣品溶液，PBS溶液或絲氨酸標準液400 μL與鄰苯二甲醛3 mL，2 min后在340 nm處測溶液的吸光度。水解度(degree of hydrolysis, DH)測定如公式(3)、(4)、(5)所示。

(3)

(4)

(5)

式中：Serine-NH2，絲氨酸氨基在每克SPI中摩爾數，mmol/g；m，樣品質量，g；P，SPI的百分比含量，%；0.1，樣品溶液體積數，L；β，0.342；α，0.97；htot，7.80。

1.3.8 抗氧化活力測定-ABTS法

參照RE等[20]的方法并稍作修改，在pH 7.0的PBS溶液(0.01 mol/L)中加入0.067 g過硫酸鉀和0.38 g ABTS后于暗處反應12～16 h制得ABTS儲備液。并用上述PBS溶液稀釋至734 nm下吸光度為0.7±0.02。取100 μL，5 mg/mL的SPI、SPI-花青素復合物(胃腸消化前后)或復合物中對應含量的花青素(結合花青素)樣品溶液，與100 μL ABTS儲備液在暗處反應7 min后測吸光度。以PBS溶液作對照，Trolox為當量，得到Trolox濃度(x)與吸光度(y)的標準曲線：y=-178.21x+0.318 9，R2=0.99。

1.3.9 抗氧化活力測定-DPPH法

參照BRAND-WILLIAMS等[21]的方法并稍作修改，取上述5 mg/mL樣品溶液100 μL與等量DPPH溶液于暗處反應，30 min后在517 nm處測吸光度。以PBS溶液作對照，Trolox為當量，得到Trolox濃度(x)與吸光度(y)的標準曲線：y=-49.113x+0.074 0，R2=0.99。

1.3.10 數據統(tǒng)計及分析

每組實驗重復3次，利用IBM SPSS Statistics軟件進行相關性分析(P<0.05)及差異顯著性檢驗(ANOVA)，后采用Origin 2018 64 Bit軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 復合物的分子量分布分析

體積排阻色譜可用于蛋白質分子量測定，依據色譜柱內凝膠的排阻效應，通過凝膠的微孔對不同半徑的蛋白分子進行分離[13]。如表1所示，與SPI相比，共價機制下復合物CC1、CC2、CC3分子量>100 kDa的組分所占比例顯著增加(P<0.05)，而非共價機制下復合物NCM1、NCM2、NCM3無顯著變化(P>0.05)，這說明共價作用機制下有大分子衍生物生成[18]。上述現象可能是由于在共價機制下(堿性條件)，花青素被氧氣分子氧化后與SPI發(fā)生親核反應[6]，這種互作能夠對SPI產生顯著影響并生成大分子衍生物，使共價機制下復合物樣品的分子量分布產生明顯變化。

表1 SPI及SPI-花青素復合物的樣品分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of SPI and SPI-anthocyanin complexes

注：非共價機制下的SPI-花青素復合物樣品：NCM1(0. 17 g/L花青素)；NCM2(0. 25 g/L花青素)；NCM3(0. 50 g/ L花青素)。共價機制下的SPI-花青素復合物樣品：CC1(0. 17 g/L花青素)；CC2(0. 25 g/L花青素)；CC3(0. 50 g/L花青素)；標注不同字母表明樣品間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 復合物結合程度分析

由圖1可知，共價機制下SPI與花青素的結合率范圍為95.0%～97.1%，而非共價機制下兩者的結合率則為68.7%～79.3%，樣品CC1、CC2、CC3的結合率和結合量均分別顯著高于NCM1、NCM2、NCM3(P<0.05)，其中樣品CC2、CC3每毫克SPI結合花青素量分別比樣品NCM2、NCM3高30.43%、42.86%。這主要因為對于共價作用機制，在pH 9時花青素可被堿性環(huán)境誘導為醌，與SPI側鏈中的氨基和巰基形成C—N、C—S化學鍵，在此機制下兩者的結合較穩(wěn)定[22]；而對于非共價作用機制，在中性pH時非共價作用先由疏水作用產生，隨后由酚羥基與SPI形成氫鍵，此非共價鍵較弱且不穩(wěn)定[7]，因此共價機制下同濃度花青素與SPI的結合率、結合量都顯著高于非共價。無論是共價/非共價機制下，隨著花青素添加量增多，SPI結合花青素量也越高。

圖1 SPI-花青素復合物的樣品花青素結合量、結合率Fig.1 Anthocyanin binding amount and binding rate of SPI-anthocyanin complex

2.3 體外模擬消化水解度(DH)分析

DH是評估體外消化的重要指標[23]。如圖2所示，全部樣品的DH在體外消化期間呈現出大致相同的上升趨勢，且在胃或小腸消化階段，前30 min內DH上升速度較快，30 min后DH上升速度均減緩。這可能是因為在胃或小腸消化階段內，隨著時間的推移，胃蛋白酶、胰酶的活性降低，水解所得消化物積累造成的[24]。

根據圖2還可觀察到，共價機制下復合物DH在消化過程中均較SPI高，促進SPI消化；非共價則較SPI低，SPI消化被抑制，且隨著復合物結合花青素量升高，DH變化越明顯。與上述現象相似，STOJADINOVIC等[11]發(fā)現β-乳球蛋白與可可多酚的非共價作用抑制蛋白消化。JIANG等[17]發(fā)現共價處理后花青素能夠促進SPI的消化率。推測花青素對SPI消化產生不同影響的原因有2種：第一可能是與酶的可及性有關，SPI具有較緊密的空間結構，不利于酶的催化作用[23]。在非共價作用機制下，花青素的羥基與SPI中氨基酸殘基通過氫鍵結合，形成的結構使酶與SPI在空間上的結合有阻礙[25]，這可能導致蛋白的DH降低；共價作用機制下，花青素與SPI中巰基、氨基酸的結合會改變SPI的緊密結構，使酶更易于與SPI接觸[26]，酶的可及性增強，催化作用被促進，蛋白質的DH升高。第二可能是與消化酶本身有關，胃蛋白酶、胰酶等消化酶是蛋白質[27]。在非共價作用機制下由于結合能力較弱，花青素易從復合物上脫落與消化酶互作[28]，消化酶可能因此不易與蛋白結合，進而降低蛋白的DH；而共價作用機制下由于結合較穩(wěn)定[29]，花青素被SPI牢牢綁定而不易從蛋白脫落，與消化酶發(fā)生互作機會小，DH較高。由于消化本身極為復雜，對于酚類與蛋白質形成的復合物，其消化性還可能與蛋白質及酚類的種類、相互作用類型有關[10]。

圖2 SPI及SPI-花青素復合物的樣品體外消化水解度Fig.2 In vitro digestion and hydrolysis degree of SPI and SPI-anthocyanin complex samples

2.4 復合物消化產物的分子量分布分析

由表2可知，與SPI相比，樣品CC1、CC2、CC3分子量>100 kDa的消化產物所占比例顯著降低，分子量<5 kDa所占比例顯著升高(P<0.05)；相反的，與SPI相比，樣品NCM1、NCM2、NCM3分子量>100 kDa的消化產物所占比例顯著升高，分子量<5 kDa所占比例顯著降低(P<0.05)，越高濃度花青素與SPI互作時，上述現象越明顯，這說明SPI與花青素在共價機制下互作有助于蛋白消化，能夠促進SPI胃腸消化水解為分子量更小的蛋白或多肽[24]，非共價則產生相反效果。上述情況出現的原因可能是在共價作用機制下，花青素中醌的C與SPI側鏈中巰基的S、氨基酸的N發(fā)生不可逆轉的共價結合，SPI因此而發(fā)生的結構變化使其更易與消化酶接觸，有利于SPI的消化[17]。而非共價作用機制下，由于花青素的羥基與SPI產生可逆的氫鍵，氫鍵的不穩(wěn)定結合使SPI的消化受到阻礙[7]，最終導致復合物消化產物的分子量分布產生差異。而花青素濃度越高，其結合量也越高，花青素對SPI的作用越強，對SPI消化的影響越大，這與上述水解度指標得到的結論是一致的。

表2 SPI及SPI-花青素復合物消化產物樣品的分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of SPI and SPI-anthocyanin complex digested product samples

2.5 抗氧化性測定-ABTS法

由圖3可知，在消化前，SPI-花青素復合物的樣品抗氧化性均高于SPI，其中樣品CC3抗氧化性最高，比SPI抗氧化性高出47.63%，且隨著SPI所結合的花青素抗氧化性增強，復合物的抗氧化性顯著升高(P<0.05)，這表明花青素的結合對復合物ABTS自由基清除能力的增強有積極作用，但復合物抗氧化性的升高幅度小于花青素抗氧化性的升高幅度，這可能是由于花青素抗氧化性主要來源于羥基[3]，而花青素的羥基與SPI的氨基酸殘基或巰基、氨基形成共價/非共價鍵[6]，使得花青素與SPI結合后賦予復合物的抗氧化性較低。消化前樣品CC1、CC2、CC3抗氧化性分別比樣品NCM1、NCM2、NCM3高18.95%、12.89%、21.32%。這是共價作用機制下SPI結合花青素的量更多造成的，這與2.2中復合物結合程度分析的結果相一致。LIU等[30]用ABTS法測定共價作用的玉米醇溶蛋白-多酚復合物抗氧化性強于非共價與本實驗結果一致。

圖3 ABTS法測消化前后SPI及SPI-花青素復合物的樣品抗氧化性Fig.3 Antioxidant properties of SPI and SPI-anthocyanin complex samples before and after digestion by ABTS

消化后樣品的抗氧化性比消化前高，主要是因為SPI經胃消化階段將SPI酶解為肽段后，腸消化階段含多種消化酶的胰酶將肽段最終水解成具有抗氧化性的多肽[25]。

2.6 抗氧化性測定-DPPH法

如圖4可知，與SPI相比，花青素與SPI的相互作用使得復合物的抗氧化性均升高。此外，復合物的抗氧化性均顯著高于SPI，且隨結合花青素的抗氧化性增強而增強(P<0.05)，這表明復合物的抗氧化性主要來源于所結合的花青素，這可能是由于花青素具有良好的抗氧化能力[30]。使用相同濃度花青素制備樣品時，共價比非共價機制下復合物的抗氧化性高。SPI與花青素共價作用機制下的花青素結合量高，這使得SPI被賦予的抗氧化性高，從而產生上述現象。ROHN等[22]發(fā)現共價作用下槲皮素與牛血清白蛋白的抗氧化性決定于槲皮素的結合量。

經胃腸體外消化后全部樣品的抗氧化性均增強，根據胃蛋白酶與胰酶的消化特性，抗氧化性增強的原因是SPI經水解生成具有抗氧化性的肽[13]。

圖4 DPPH法測消化前后SPI及SPI-花青素復合物的樣品抗氧化性Fig.4 Antioxidant properties of SPI and SPI-anthocyanin complex samples before and after digestion by DPPH method

3 結論

復合物分子量分布、結合率分析共價/非共價作用機制下SPI與花青素間互作強度差異。分子量分布表明在共價作用機制下生成大分子衍生物，而非共價無顯著現象。用同質量濃度花青素制備復合物時，共價機制下結合率、每毫克SPI結合花青素量均顯著高于非共價。

復合物消化產物的水解度、分子量分布表明，SPI與花青素在共價作用機制下的互作對復合物體外消化有促進作用，非共價則對其有抑制作用，且復合物結合花青素量越高，對體外消化影響越明顯。

抗氧化性指標(ABTS法和DPPH法)測定表明，SPI與花青素互作使SPI的抗氧化性升高，且共價作用機制下復合物的抗氧化性升高更顯著，復合物抗氧化性隨花青素結合量升高而升高，而復合物消化后的抗氧化性比消化前高。