彭鈺涵 邱小建 張杰

下呼吸道病原體的感染主要包括細(xì)菌、病毒、真菌及其他非典型微生物，而用于識別呼吸道病原體的傳統(tǒng)方法包括微生物培養(yǎng)、痰涂片染色、尿抗原檢測和血清學(xué)檢測等，這些傳統(tǒng)方法可以在一定程度上幫助識別呼吸道病原體。然而，它們都有各自的缺陷，比如：敏感性差，耗時(shí)較長，缺乏專業(yè)培養(yǎng)基，延遲應(yīng)答等[1]。隨著人類對探索生命奧秘的渴求，作為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)的DNA測序技術(shù)得以迅速發(fā)展。20世紀(jì)，Sanger測序法(也被稱為第一代測序法)應(yīng)運(yùn)而生，它具有高效率和低放射性，但也因成本過高、耗時(shí)、不夠精準(zhǔn)等原因發(fā)展受限。為使基因測序更加便捷，同時(shí)降低成本，能大規(guī)模并行分析基因、具有高通量優(yōu)點(diǎn)的下一代測序技術(shù)(next-generation sequence,NGS)得以研發(fā)并被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[2]。目前NGS可作為研究病原體特征的一個(gè)工具，在了解病原體的毒力特征、預(yù)測疾病嚴(yán)重程度、感染結(jié)果以及疾病早期發(fā)病期間進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估等方面起著至關(guān)重要的作用[3]。本文就NGS在下呼吸道感染病原學(xué)中的應(yīng)用展開論述。

1 NGS代表平臺

新一代測序技術(shù)興起之初，有3個(gè)典型的代表平臺及相應(yīng)的系統(tǒng)，分別是Roche的羅氏454系統(tǒng)、Life Science的SOLiD/Torrent PGM系統(tǒng)、Illumina平臺的GA/HiSeq/Miseq系統(tǒng)。其Ion Torrent PGM和Illumina MiSeq因其小體積和快速周轉(zhuǎn)率等優(yōu)勢，在臨床和小型實(shí)驗(yàn)室中得以廣泛應(yīng)用[2]。在Castelino等[4]的研究中，基于細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)來捕獲NGS的群落多樣性，比較了Illumina MiSeq與Roche 454 系統(tǒng)，并證實(shí)二者捕獲了相同的細(xì)菌多樣性，但I(xiàn)llumina MiSeq在吞吐量和成本效益顯示出優(yōu)勢。Quail等[5]研究表明，Ion Torrent平臺的錯(cuò)誤率高于Illumina平臺。據(jù)統(tǒng)計(jì)，隨著羅氏454測序平臺即將停產(chǎn)以及SOLiD和IonTorrent系統(tǒng)的低采用率，細(xì)菌基因組測序幾乎全部在Illumina測序儀上進(jìn)行[6]。

Illumina的代表系統(tǒng)主要有MiniSeq，MiSeq，NextSeq，Hiseq，HiSeq X Ten，NovaSeq等系列。2013年，Miseq作為第一個(gè)NGS平臺由美國食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床，已多次應(yīng)用于臨床微生物檢測，是目前較為可靠的病原學(xué)檢測手段。NextSeq是illumina第二款獲批平臺，可在高產(chǎn)量和中等產(chǎn)量兩種模式下展開測序，與Miseq相比，更加靈活、經(jīng)濟(jì)，但目前應(yīng)用于呼吸道病原檢測的相關(guān)研究不多。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，第三代測序平臺PacBio的Sequel/RSI系統(tǒng)可彌補(bǔ)Illumina的短讀缺陷，也在速度上具有優(yōu)勢，但其成本遠(yuǎn)高于Illumina。另一種能夠進(jìn)行單分子測序的測序技術(shù)是ONT MinION技術(shù)(也被稱為第四代測序)，是目前市場上產(chǎn)量最高的平臺，與Illumina相比，在成本、運(yùn)行時(shí)間、輸出方面均有優(yōu)勢，但目前尚是一項(xiàng)正在開發(fā)的技術(shù)，錯(cuò)誤率、標(biāo)準(zhǔn)化等問題也有待解決[7]。

2 NGS在檢測不同下呼吸道病原體中的作用與特性

2.1 病毒 病毒是下呼吸道感染中不可忽視而又難以準(zhǔn)確檢測的病原體之一，目前的檢測方法有抗原檢測、PCR、病毒分離、血清學(xué)IgG及IgM等[8]。而病毒特異性分子檢測被認(rèn)為是診斷呼吸道病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，具有快速、價(jià)格低，并比現(xiàn)有的技術(shù)(如病毒培養(yǎng)、直接熒光免疫)有更高的靈敏度和特異性。但該技術(shù)受靶向病原體數(shù)量的制約，而且需要持續(xù)監(jiān)測以確保靈敏度及特異性，以及不斷的更新信息庫以覆蓋新出現(xiàn)的病原體。而NGS可以解決這些問題并可能徹底改變呼吸道病毒診斷[9]。Bialasiewicz等[10]將RT-PCR與新一代測序方法組合起來，發(fā)現(xiàn)了一株副流感病毒4(PIV4)的變異菌株，證實(shí)了RT-PCR與新一代測序技術(shù)組合的方法在識別新型病毒病原體中的效用。在Thorburn等[9]的研究中，NGS可以為檢測到的病毒提供更詳細(xì)的類型信息，包括病毒的亞型數(shù)據(jù)及血清型數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上還可提供抗性測試，如甲型流感的H275Y突變，賦予了奧司他韋抗性，這對爆發(fā)性流感的診治起到不可替代的作用。未來，它還可能檢測出與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的病毒多態(tài)性。這種優(yōu)勢不僅體現(xiàn)在病毒診斷上，更能指導(dǎo)臨床進(jìn)行有針對性的用藥，避免抗生素濫用，減少多重耐藥病原體的感染。

2.2 細(xì)菌 下呼吸道細(xì)菌感染主要有肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性桿菌等，相關(guān)的檢測方法主要包括革蘭氏染色、痰液、支氣管肺泡灌洗液或其他下呼吸道分泌物的培養(yǎng)、血培養(yǎng)、血清學(xué)研究、抗原檢測、PCR等，但這些檢測方法受標(biāo)本污染、抗生素應(yīng)用等情況的制約，目前尚未有理想的檢測方法[8]。在Abayasekara等[11]的研究中，采用NGS方法針對細(xì)菌16S rRNA基因區(qū)域檢測所得結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對比，并以培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析比較了各種臨床樣本(其中包含氣管分泌物及痰標(biāo)本)，并通過NGS檢測多種鏈球菌類、葡糖球菌屬、克雷白桿菌屬等菌類。結(jié)果證實(shí)基因檢測結(jié)果與培養(yǎng)陽性的一致率可達(dá)91.8%。在Mellmann等[12]的研究中也證實(shí)了NGS在應(yīng)用于細(xì)菌基因分型中的高度重復(fù)性及準(zhǔn)確性。

2.3 真菌 在檢測真菌感染方面，He等[13]報(bào)道了3例重癥肺炎煙曲霉菌感染的病例，采用NGS對肺泡灌洗液樣本進(jìn)行檢測，其中2例經(jīng)傳統(tǒng)方法、NGS證實(shí)，1例僅通過NGS證實(shí)(其他常規(guī)結(jié)果陰性)，在獲得NGS結(jié)果后，應(yīng)用單獨(dú)抗真菌藥物治療后恢復(fù)(此前均未接受任何抗生素治療)。Abayasekara等[11]采用了真菌ITS1基因區(qū)域的下一代測序?qū)粑罉?biāo)本進(jìn)行真菌感染檢測，由于未能有培養(yǎng)結(jié)果對比，尚無法評估，但其檢測結(jié)果中10.3%的標(biāo)本測得真菌陽性，也在一定程度上證實(shí)了NGS檢測真菌的能力。NGS在真菌檢測上的突出優(yōu)勢不僅在于檢測出多種真菌，還可以檢測出耐多藥菌株突變的耐藥基因，分析其多種耐藥機(jī)制[14,15]，從而為臨床治療提供參考。

2.4 其他病原體

2.4.1 檢測結(jié)核分枝桿菌(MTB)：基于其獨(dú)特的生理學(xué)及基因組成，合理選擇文庫構(gòu)建十分重要，在Tyler等[16]的研究中表明，MTB NGS數(shù)據(jù)質(zhì)量高度依賴于提交測序的DNA樣品的純度及其鳥嘌呤-胞嘧啶含量(或GC含量)，而Illumina TruSeq文庫制備試劑盒可以產(chǎn)生比Nextera XT方法更均勻的數(shù)據(jù)質(zhì)量，這為檢測結(jié)核桿菌提供了更加準(zhǔn)確的方向。Walker等[17]應(yīng)用Illumina技術(shù)對MTB基因進(jìn)行測序，通過這種方式識別超級傳播者及潛伏期的患者，使得感染的患者及其接觸者得到早期治療。應(yīng)用這種技術(shù)還可確定傳播過程的微進(jìn)化事件，即確定每個(gè)導(dǎo)致繼發(fā)性病例的傳播事件的0～2個(gè)單核苷酸多態(tài)性，從而掌握傳播鏈中新的流行病鏈接[18]。目前NGS應(yīng)用于MTB傳播方面的研究較多，充分展現(xiàn)出基因檢測在阻止結(jié)核傳播中發(fā)揮的優(yōu)勢。

2.4.2 鑒定肺炎支原體感染：包括病原體特異性抗原或核酸的培養(yǎng)，血清學(xué)分析或分子檢測，如前文所述，這些檢測有弊端，如耗時(shí)長、特異性及敏感性差等。而基因組測序有可能徹底改變肺炎支原體生物學(xué)和流行病學(xué)領(lǐng)域，并在了解可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)變異和改進(jìn)支原體基因分型的潛在多位點(diǎn)VNTR分析方案上提供了新見解，具有更好的鑒別能力[19,20]。

3 不同下呼吸道標(biāo)本的特點(diǎn)及其在NGS診斷中的應(yīng)用

3.1 血標(biāo)本 病原體的血清學(xué)檢測及血培養(yǎng)常規(guī)應(yīng)用于下呼吸道感染病原體檢測，但耗時(shí)長、陽性率低?？梢詿o偏倚地測定全部核苷酸序列的新一代測序技術(shù)可直接檢測血標(biāo)本，這在一定程度是避免了難以培養(yǎng)的病原體的漏檢。Long等[21]的研究采用NGS和培養(yǎng)2種方法對78例ICU患者血漿標(biāo)本進(jìn)行分析，通過PCR及Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)以10例健康患者NGS的血漿標(biāo)本結(jié)果作為陰性對照，結(jié)果NGS在15例標(biāo)本檢測出細(xì)菌或真菌，14例檢測出病毒感染(其中9種由Sanger測序驗(yàn)證)，培養(yǎng)診斷10例含細(xì)菌、真菌的標(biāo)本，7例標(biāo)本經(jīng)NGS和培養(yǎng)共同診斷為細(xì)菌或真菌感染。該研究認(rèn)為：(1)整體診斷敏感性由培養(yǎng)的12.82%(10/78)提高到NGS的30.77%(24/78)，證實(shí)NGS可提高診斷敏感性。(2)如果以培養(yǎng)作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)(細(xì)菌或真菌被培養(yǎng)出即陽性)，NGS細(xì)菌分析的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)分別為72.7%、89.6%、53.3%、95.2%和62.3%。采用McNemar’s χ2test 檢驗(yàn)，陽性和陰性結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.343)；一致性檢驗(yàn)表明，培養(yǎng)與NGS兩種方法具有一定的一致性(k=0.54，P<0.001)。(3)當(dāng)NGS和培養(yǎng)聯(lián)合時(shí)，被鑒定為陽性的樣本從12.82%(10/78)增加到23.08%(18/78)。McNemar’s χ2檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)，證實(shí)NGS與培養(yǎng)聯(lián)合的診斷率優(yōu)于單一培養(yǎng)。

3.2 痰標(biāo)本 痰標(biāo)本涂片與培養(yǎng)是臨床中常用的方法，采集方法主要有經(jīng)口咳出、吸痰管吸引、經(jīng)支氣管鏡采樣等。經(jīng)口咳出容易受口咽部定制植菌污染等影響，經(jīng)吸痰管吸引多用于建立人工氣道的危重患者，可能損傷氣道黏膜，加重缺氧，引起肺不張等后果，經(jīng)支氣管鏡采集痰標(biāo)本創(chuàng)傷較小，出于費(fèi)用、耐受性方面考慮，目前也難以作為常規(guī)性檢查，但對于重癥及難治性下呼吸道感染患者有較大意義。Dunlap等[22]報(bào)道了1例重癥細(xì)菌性肺炎患者NGS的氣管內(nèi)抽吸物的回顧性研究，該患者入院后血培養(yǎng)示壞死梭桿菌，痰培養(yǎng)示呼吸道正常菌群，氣管內(nèi)抽吸物及支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)均陰性，后對胸腔積液進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查示人支原體，應(yīng)用阿奇霉素后好轉(zhuǎn)出院。該研究回顧性應(yīng)用NGS對于第1、3、7天的氣管內(nèi)抽吸物進(jìn)行檢測，均檢測出梭桿菌及支原體，該研究認(rèn)為對危重患者提供及時(shí)NGS結(jié)果，有利于診斷及及時(shí)治療。Kalantar等[23]選取了52例急性呼吸系統(tǒng)疾病患者，其中15例是由培養(yǎng)證實(shí)的細(xì)菌性肺炎患者，12例急性呼吸衰竭非肺炎患者，25例臨床疑似肺炎的急性呼吸道疾病患者(培養(yǎng)陰性)。通過Illumina 平臺對支氣管肺泡灌洗液與氣管內(nèi)抽吸物標(biāo)本進(jìn)行氣道微生物群評估，其中肺泡灌洗液標(biāo)本的mNGS檢測了全部23種培養(yǎng)鑒定的微生物，氣管內(nèi)抽吸物標(biāo)本的mNGS檢測了22種微生物。有差異的微生物來自多微生物培養(yǎng)標(biāo)本，在氣管內(nèi)抽吸物標(biāo)本中被mNGS檢測，但相對豐度低于1%，根據(jù)生物信息背景，未列入內(nèi)。該研究認(rèn)為:(1)兩種標(biāo)本物種豐度差異不大：認(rèn)為肺泡灌洗液與氣管內(nèi)抽吸物間屬的相對豐度的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.72(95%CI：0.68～0.76)表明二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在細(xì)菌性肺炎患者中發(fā)現(xiàn)了二者顯著的組分相似性，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.92(95%CI：0.88～0.95)。(2)每百萬條閱讀序列的總屬比對沒有顯著差異(Wilcoxon秩和計(jì)算分析)，氣管內(nèi)抽吸物中位數(shù)為43.3，肺泡灌洗液為26.89，P=0.66，二者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)口咽部常見微生物區(qū)系豐度無顯著差異：根據(jù)Bray-Curtis差異指數(shù)(P=0.31)，沒有發(fā)現(xiàn)微生物β-多樣性在兩種標(biāo)本間的顯著差異(P=0.31)。該研究認(rèn)為，肺泡灌洗液和氣管抽吸物在生物覆蓋，口咽部菌群豐富度和微生物多樣性方面都有相似性，與具有侵入性的肺泡灌洗液相比，在細(xì)菌性肺炎上氣管內(nèi)抽吸物提供了相類似的氣道微生物評估。

3.3 肺泡灌洗液標(biāo)本 肺泡灌洗液一直被認(rèn)為是鑒定細(xì)菌的最佳生物樣品[24]，導(dǎo)管防污染保護(hù)性灌洗可封堵遠(yuǎn)端及亞段的支氣管，在一定程度上減少了污染的機(jī)會(huì)，可以提高病原菌檢測的準(zhǔn)確性。目前針對下呼吸道微生物分析大多應(yīng)用肺泡灌洗液標(biāo)本。He等[13]通過NGS對肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行檢測，證實(shí)了3例重癥肺炎煙曲霉菌感染。Sung等[25]通過對肺泡灌洗液標(biāo)本的檢測，表明NGS揭示了比培養(yǎng)更多樣化的細(xì)菌群落，而培養(yǎng)則對檢測某些細(xì)菌更敏感，如葡萄球菌屬，梭狀芽孢桿菌屬和雙歧桿菌屬等。Dickson等[26]收集了33例肺移植患者的46例肺泡灌洗液標(biāo)本，其中21例有急性肺部感染癥狀，25例為陰性無癥狀患者。46例肺泡灌洗液標(biāo)本中有18例(39.1%)檢出一種或多種細(xì)菌，19例(41.3%)標(biāo)本中僅檢測出口腔菌群。在44份(95.7%)標(biāo)本中用NGS檢測到細(xì)菌DNA，這一比例明顯高于通過任何培養(yǎng)生長檢測到的細(xì)菌(P<0.05)。Langelier等[27]收集22名造血干細(xì)胞移植后急性下呼吸道感染患者的肺泡灌洗液，結(jié)果：(1)7例患者(32%)經(jīng)臨床診斷鑒定出微生物(mNGS均檢測出)，其中6例經(jīng)醫(yī)師認(rèn)定為病原體。此外mNGS在6例常規(guī)檢測陰性的患者中檢測出了社區(qū)獲得性肺炎常見的病原體。(2)通過對微生物的α多樣性評估，發(fā)現(xiàn)經(jīng)證實(shí)存在致病病原體患者的Simpson多樣性指數(shù)(中位數(shù)，0.34[區(qū)間范圍(IQR)，0.15～0.64)]，Wilcoxon秩和)顯著低于未檢測出或不確定致病病原體的患者(中位數(shù)，0.92[IQR，0.86～0.93]，Wilcoxon秩和)，P=0.017。(3)從分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫中篩選出與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因集，發(fā)現(xiàn)在確診下呼吸道感染病原體的患者的基因集(中位數(shù)，94.9[IQR，93.8～105.6]，Wilcoxon秩和)顯著大于未檢測出或不確定致病病原體的患者(中位數(shù)，33.1[IQR，20.7～75.1]，Wilcoxon秩和)，P=0.022。該研究證明，與目前的微生物診斷相比，mNGS具有更強(qiáng)的微生物檢測能力和將病原體檢測與宿主反應(yīng)和氣道微生物同時(shí)檢測相結(jié)合的能力。

3.4 刷檢標(biāo)本 支氣管鏡檢查中的防污染保護(hù)性毛刷(PSB)是下呼吸道采集標(biāo)本的方法之一。Gr?nseth等[28]收集了67例慢性阻塞性肺疾病和56例對照組的呼吸道標(biāo)本，通過Illumina Miseq測序平臺分析標(biāo)本中的氣道微生物，認(rèn)為微生物多樣性α指數(shù)在口腔沖洗、小容量灌洗、保護(hù)性的肺泡灌洗、保護(hù)性毛刷刷檢標(biāo)本中依次減少，分類群相對豐度β指數(shù)因采樣方法而異，刷檢標(biāo)本距離矩陣分離得比小容量灌洗、保護(hù)性肺泡灌洗標(biāo)本更為清楚(分別與口腔沖洗標(biāo)本進(jìn)行比較)。且標(biāo)本采集的順序(左側(cè)優(yōu)先或右側(cè)優(yōu)先)不影響刷檢標(biāo)本中的α、β指數(shù)。該研究證明，保護(hù)性的肺泡灌洗液(PBAL)、保護(hù)性毛刷刷檢樣品(PSB)與口咽部菌群的差異大于未受保護(hù)的，是較好的采樣方法。目前防污染保護(hù)性毛刷是可以通過NGS檢測病原菌、在一定程度上受污染影響較小的方法。

3.5 組織標(biāo)本 肺活檢組織病理學(xué)一直具有極高的準(zhǔn)確性，而關(guān)于mNGS在肺活檢組織中應(yīng)用的報(bào)道仍然很少。Li等[29]選取了20例疑似肺部感染患者的CT引導(dǎo)下肺穿刺活檢組織進(jìn)行常規(guī)及NGS檢測，其中培養(yǎng)陽性8例(包括曲霉菌、葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、青霉菌)，12例涂片陽性(包括真菌、抗酸菌、革蘭陰性桿菌)，13例組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)真菌及抗酸菌，15例mNGS陽性(包括細(xì)菌、真菌、結(jié)核分枝桿菌)，3例臨床核酸檢測陽性(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體)，得出結(jié)論，(1)mNGS與涂片方法相比：細(xì)菌的敏感性、特異性分別為50.0%(95% CI:2.7%～97.3%)、66.7%(95% CI:41.2%～85.6%)，真菌的敏感性、特異性分別為62.5%(95% CI:25.9%～89.8%)、66.7%(95% CI:35.4%～88.7%)，結(jié)核分枝桿菌的敏感性、特異性分別為100%(95% CI:19.8%～100%)、88.9%(95% CI:63.9%～98.1%)。(2)mNGS與培養(yǎng)方法相比，細(xì)菌的敏感性、特異性分別為：100%(95% CI:31.0%～100%)、76.5%(95% CI:49.8%～92.2%) 真菌的敏感性、特異性分別為57.1%(95% CI:20.2%～88.2%)、61.5%(95% CI:32.2%～84.9%)，且陽性預(yù)測值(細(xì)菌42.9%，真菌44.4%)明顯低于陰性預(yù)測值(細(xì)菌100%，真菌72.7%)。(3)mNGS與組織病理學(xué)方法比較，真菌和結(jié)核分枝桿菌的特異性分別為100%、94.1%，陽性預(yù)測值分別為100%和75.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。該研究通過mNGS在肺活檢組織感染性病原體診斷中的應(yīng)用，成功地識別了20例患者中的15例，證實(shí)了NGS應(yīng)用于肺部組織標(biāo)本感染診斷的可行性及意義。

4 NGS的判讀方法

目前對于NGS如何判斷致病菌尚未有一致的標(biāo)準(zhǔn)。Long等[21]認(rèn)為判斷致病菌需滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：首先在一個(gè)樣本中識別的所有病原體必須按照每個(gè)病原體的覆蓋度進(jìn)行分類，得出前十位病原體(覆蓋度須超過參考范圍上限)，在前十位病原體中，挑選出序列數(shù)>3的病原體(序列數(shù)超過參考范圍上限)，再根據(jù)疑似病原體的致病性和患者的臨床癥狀，由高級醫(yī)生確定可能的病原體及經(jīng)驗(yàn)性治療，出具實(shí)驗(yàn)室報(bào)告后，調(diào)整抗感染策略，納入針對性治療。這種判斷方法在不同微生物覆蓋度的差異、考慮免疫功能缺陷患者、特殊的致病菌時(shí)仍有待進(jìn)一步討論。朱逸敏等[30]認(rèn)為抗微生物治療對測序結(jié)果也有巨大的影響，在接受經(jīng)驗(yàn)性治療后的患者中，應(yīng)采用更為寬松的病原體判讀標(biāo)準(zhǔn)以提高陽性率，但這也將導(dǎo)致準(zhǔn)確性及靈敏度的下降。Li等[29]根據(jù)以下3個(gè)條件確定來致病菌：(1)細(xì)菌或真菌屬水平上>30%的相對豐度；(2)培養(yǎng)和(或)組織病理學(xué)檢查呈陽性，并且至少從一種細(xì)菌或真菌中獲得50種獨(dú)特的序列片段；(3)MTBC結(jié)核至少有一個(gè)惟一序列片段。通過以上方法，在20名患者中確定了致病菌15名，但該研究樣本量小，需進(jìn)一步研究支持。Langelier等[27]認(rèn)為致病病原體需滿足：(1)臨床常規(guī)檢測和mNGS共同確認(rèn)；(2)有文獻(xiàn)證實(shí)其在肺部的致病性；(3)每百萬閱讀序列至少比在患者中發(fā)現(xiàn)的任何其他類型的微生物(病毒、細(xì)菌或真菌)高出2倍。微生物可認(rèn)為是新的潛在病原體：(1)僅用mNGS鑒定微生物，并且符合上述標(biāo)準(zhǔn)2和3；(2)所有其他微生物都被認(rèn)為是不可能的或不確定的病原體；(3)病毒PCR或細(xì)菌16S rRNA基因測序證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)，這種判讀方法基于的樣本量較小，且需通過PCR等方法驗(yàn)證，時(shí)間、成本上不利于臨床應(yīng)用。

總之，NGS尚未納入下呼吸道病原微生物的常規(guī)檢測，在爆發(fā)性、重癥、難治性呼吸道感染方面的應(yīng)用得到了一致性的認(rèn)可，NGS在不同程度上提高了病毒、細(xì)菌、真菌及非典型性病原體的檢出率，并具有較高的準(zhǔn)確性，提供更多的信息。還可通過對血、痰、肺泡灌洗液、刷檢、活檢等標(biāo)本的檢測，分析病原微生物，優(yōu)化臨床的診斷與治療。目前還有很多問題有待進(jìn)一步研究，如各種下呼吸道標(biāo)本的規(guī)范化采集方法、何種標(biāo)本是檢測呼吸道病原體的最優(yōu)標(biāo)本、致病微生物的判讀“金標(biāo)準(zhǔn)”等。