●毛倩倩 林久茂，2▲

腫瘤是威脅人類生命健康的重大疾病之一。雖然免疫和靶向治療使當下腫瘤治療取得了重大進展，但仍然存在患者響應(yīng)率低、易產(chǎn)生耐藥性、副作用大等多種問題[1，2]。而中醫(yī)藥因具有整體調(diào)節(jié)和毒副作用小等特點，臨床治療各類惡性腫瘤療效顯著，備受廣大癌癥患者的青睞。傳統(tǒng)中藥黃芪具有扶正抑瘤作用，其重要活性成分黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）因能夠直接、間接殺傷腫瘤或協(xié)同化療發(fā)揮多重抗腫瘤活性，并且具有安全性，因而在腫瘤領(lǐng)域備受關(guān)注。黃芪多糖作為黃芪主要有效成分之一，除抗腫瘤作用外，還有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、降血糖等多種作用[3]，具有良好的應(yīng)用前景。由于黃芪多糖的抗腫瘤作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而其提取、結(jié)構(gòu)表征具有復(fù)雜性，所以本文對黃芪多糖結(jié)構(gòu)表征簡要概述，主要針對黃芪多糖近年來抗腫瘤方面的研究進行綜述。

1 黃芪多糖結(jié)構(gòu)表征

黃芪多糖的提取方法種類多，有溶劑法、酶輔助法、微生物發(fā)酵法、物理強化法等；純化的常用方法有Savege法、酶法、分級沉淀、層析柱法、膜分離等[4]。由于黃芪多糖提取純化手段多樣，其性質(zhì)與生物活性也有差別。結(jié)構(gòu)表征測定主要包括多糖含量測定、分子量測定、單糖組成及比例、糖鏈的連接順序、糖苷鍵的類型以及結(jié)構(gòu)等幾個方面[3]。

多糖含量的經(jīng)典檢測方法比色法（紫外分光光度法）有兩種，分別為苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法[5]。近些年測定相對分子質(zhì)量最常用的方法是高效凝膠色譜法（GPC）及GPC-MALLS（多角度激光光散射）聯(lián)用法[6]。據(jù)報道[7]，黃芪多糖的分子量多集中在10000～50000Da。分子量不同的多糖，其單糖組成、比例以及糖鏈連接順序及糖苷鍵類型也會有差異[3]。解析單糖組成及比例的技術(shù)手段主要包括高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[3]。已有的研究表明[5，7-9]，黃芪多糖是由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等多種單糖組成的。劉衛(wèi)寶等[9]通過FT-IR、1H-NMR 分析其提取的黃芪多糖同時包含α-型吡喃糖和β-型吡喃糖。

2 抗腫瘤作用及機制

2.1 調(diào)節(jié)腫瘤免疫

2.1.1 促進固有免疫 巨噬細胞是單核-吞噬系統(tǒng)的重要組成部分，也是固有免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細胞。激活的巨噬細胞可以直接吞噬異物、病原體、殺死腫瘤細胞，還可以釋放細胞因子間接殺死腫瘤細胞[10]。周麗菁等[11]構(gòu)建人源型巨噬細胞THP-1-乳腺癌細胞株MDA-MB-231 共培養(yǎng)體系，經(jīng)黃芪多糖干預(yù)后，MDA-MB-231 的增殖、遷移侵襲受到抑制，凋亡增加；并且發(fā)現(xiàn)黃芪多糖干預(yù)單獨培養(yǎng)THP-1 細胞NO、IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子分泌水平增加。Li 等[12]研究表明黃芪多糖干預(yù)RAW264.7小鼠巨噬細胞后的培養(yǎng)上清液對小鼠乳腺癌細胞4T1 具有明顯的抑制作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以通過激活RAW264.7 小鼠巨噬細胞的TLR4/MyD88信號通路，進而活化其下游分子TRAF-6、NF-κB p65 和AP-1，促使巨噬細胞分泌各種細胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。

此外，有研究顯示[14-15]黃芪多糖也可以增強白血病細胞HL-60細胞對NK 細胞的殺傷敏感性，其機制可能是通過上調(diào)HL-60 細胞表面的MICA（NK細胞表面關(guān)鍵活化受體NKG2D 的配體）活化來實現(xiàn)的。

2.1.2 促進適應(yīng)性免疫 樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）是一種專職抗原提呈細胞，能攝取抗原并啟動抗原特異性T 細胞的不同亞群，如細胞毒性T細胞、輔助性T細胞，這兩種T 細胞起到直接或間接殺傷腫瘤細胞作用[16]。因此，樹突狀細胞在啟動特異性腫瘤免疫反應(yīng)時起到了關(guān)鍵作用。廖雙葉[17]研究發(fā)現(xiàn)蜜炙黃芪多糖干預(yù)過后的人肺癌細胞A549 表面的MHC 分子、Hsp-70、鈣網(wǎng)蛋白等與免疫原性死亡相關(guān)的蛋白和信號分子的表達水平升高；通過流式細胞術(shù)檢測到蜜炙黃芪多糖可以促進小鼠骨髓來源DC 的成熟，提高其活化和抗原提呈能力。Pang 等[18]制備的黃芪多糖納米粒子能通過TLR活化DC，使DC表面的共刺激分子表達增加、提呈腫瘤抗原能力增強、促使DC高效遷移至淋巴結(jié)，以激活淋巴結(jié)處的初始T 細胞，抑制繼發(fā)性腫瘤生長。

Th1和Th2 是輔助性T細胞的兩種亞群，正常情況下，Th1和Th2處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，并相互制約，以維持機體正常的免疫功能。腫瘤患者體內(nèi)發(fā)生Th1 細胞受到抑制而Th2 細胞占優(yōu)勢的現(xiàn)象稱為Th1/Th2 平衡漂移。荊雪寧等[19]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖誘導的DC疫苗能糾正S180 荷瘤小鼠的Th1/Th2 失衡，改善免疫狀態(tài)，增強抗腫瘤的免疫功能。

2.1.3 逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制 腫瘤及其微環(huán)境是由腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、免疫細胞等細胞成分以及非細胞成分組成的復(fù)雜集合體[20]。正常情況下，免疫系統(tǒng)可以識別和清除突變的細胞。然而，腫瘤微環(huán)境中存在的一些免疫抑制細胞（如調(diào)節(jié)性T 細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、骨髓來源抑制細胞等）以及其產(chǎn)生的能夠促進癌細胞生長或抑制腫瘤免疫的細胞因子限制了這種免疫監(jiān)視作用。

調(diào)節(jié)性T 細胞(Regulatory T cells，Tregs)是一把雙刃劍，具有調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)的作用，也能在不同病理環(huán)境下抑制免疫反應(yīng)[21]。CD 4+CD25+Foxp3+是Tregs 的經(jīng)典表面標記組合。在腫瘤微環(huán)境中，它們能夠通過分泌IL-35、IL-10 和TGF-β 等免疫抑制分子、促進CD8+T 細胞和NK 細胞溶解、抑制T 細胞代謝、抑制DC 成熟和功能等途徑促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展[22]。左博靖[23]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以誘導Tregs 細胞向免疫無能性分化，明顯下調(diào)CD4、CD25 的表達，減少細胞因子IL-10 和TGF-β 的分泌。

巨噬細胞是腫瘤基質(zhì)中最豐富的細胞，具有顯著的可塑性，可在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮多種功能。腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞通常分為經(jīng)典M1和M2（也稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞）。M2 能直接影響腫瘤發(fā)展的多個步驟，包括癌細胞存活、增殖、侵襲性以及血管生成和免疫抑制；還能間接通過與腫瘤進展相關(guān)細胞的相互作用，或者與負調(diào)節(jié)腫瘤抑制細胞來發(fā)揮這些功能[24]。研究表明黃芪多糖顯著增加了非小細胞肺癌細胞H441和H1299的M1/M2巨噬細胞極化率，并且在非小細胞肺癌小鼠模型中異種移植瘤的生長受到抑制，以及M2 數(shù)目顯著減少，呈時間依賴性[25]。

骨髓來源抑制細胞（Myeloidderived suppressor cells，MDSC）是免疫抑制腫瘤微環(huán)境的主要驅(qū)動因素之一，其可以誘導Tregs 的增殖，促使巨噬細胞向M2 型巨噬細胞發(fā)展，可直接殺傷免疫效應(yīng)細胞，抑制機體免疫，使腫瘤產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象[26]。柴旺[27]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖抑制了皮下黑色素瘤荷瘤小鼠脾內(nèi)的Grl+CD11b+MDSC 生成。劉素霞[28]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以降低HLA-DR-CDl4-CD33+MDSC在外周血單個核細胞中的數(shù)量，并指出可能通過促進MDSC 分化成熟而降低MDSC的比例。

免疫檢查點分子是癌細胞阻斷抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要免疫抑制機制之一。程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1），可選擇性地與程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）或程序性死亡配體2（programmed death-ligand 2，PD-L2）結(jié)合，使T細胞功能失活，在誘導癌細胞免疫逃逸方面發(fā)揮重要作用。PD-1是M2、Tregs 中發(fā)揮作用的關(guān)鍵受體之一[29]。王潔茹等[30]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能通過下調(diào)癌細胞表面的PD-L1/PD-L2 分子、脾組織PD-1 的表達及相互作用，增強T 細胞抗腫瘤免疫作用抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生長。

2.2 抑制腫瘤細胞增殖宋鑫等[31]通過噻唑藍（MTT）法檢測到黃芪多糖在體外抑制人結(jié)腸癌細胞HT-29 的半數(shù)致死量（IC50）為94.49μg/mL，且當濃度小于200μg/mL 時，黃芪多糖對HT-29 細胞的抑制作用呈劑量依賴性；利用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可使HT-29 細胞的周期阻滯于G1 期。卜威振等[32]通過MTT 法檢測到黃芪多糖在體外對前列腺癌細胞PC3 的增殖亦有抑制作用，并且具有時間和濃度的依賴性；臺盼藍染色測定PC3細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，黃芪多糖組的PC3的生長速度存在著不同程度的減慢，并呈時間依賴性。此外，黃芪多糖對肝癌細胞HepG2[33]、人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y[34]等的細胞增殖均有抑制作用。由此可見，黃芪多糖對多種癌細胞的增殖均有抑制作用。

2.3 抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移細胞遷移在腫瘤病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用，在此過程，蛋白酶不可或缺?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是與腫瘤轉(zhuǎn)移最密切相關(guān)的蛋白酶，MMPs能降解除多糖外幾乎全部的胞外基質(zhì)。其中MMP-2、MMP-9 是在腫瘤轉(zhuǎn)移中最直接、最重要的一類蛋白酶，兩種酶均可降解Ⅳ型膠原。MMP-2 又可激活MMP-9、MMP-13 呈瀑布效應(yīng)，共同介導癌細胞侵襲[35]。王旗等[36]通過劃痕實驗和Transwell 實驗發(fā)現(xiàn)黃芪多糖抑制了人結(jié)直腸癌細胞HCT116的遷移和侵襲，并且Western blot 結(jié)果顯示MMP-2 和MMP-9 的表達水平顯著降低。李超等[37]發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞RB44在黃芪多糖干預(yù)后，其遷移和侵襲能力顯著下降；相關(guān)基因蛋白MMP-2、MMP-9表達下降，但E-cadherin的表達并無明顯改變。

2.4 誘導腫瘤細胞凋亡細胞凋亡是最常見和研究最深入的程序性細胞死亡類型。質(zhì)膜和膜細胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等在細胞凋亡中的作用關(guān)鍵，各種凋亡誘導機制之間的密切聯(lián)系，并且可以從一種途徑轉(zhuǎn)換到另一種途徑，在大多數(shù)情況下，這些途徑的結(jié)果是線粒體膜滲透和/或Caspase 激活[38]。謝榮丹等[39]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能有效抑制MDA-MB-231 乳腺癌裸鼠移植瘤的生長，通過HE 染色、TUNEL 法檢測到黃芪多糖誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231 凋亡程度呈劑量依賴性，并且通過Western blot 法檢測凋亡相關(guān)蛋白、Bcl-2、Bax、Caspase-7、Caspase-9的表達水平，結(jié)果顯示Bcl-2/Bax的比值升高，Caspase-9、Caspase-7蛋白表達水平顯著升高。閻力君等[40]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖干預(yù)人結(jié)直腸癌SW620后使其Bcl-2/Bax的比值增加，Cytochrome C 以及Caspase-9、Caspase-3 的表達上升。由此可得出黃芪多糖可通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡。

2.5 抗血管新生和淋巴管新生在腫瘤的發(fā)展過程中，由于代謝需求的增加和組織缺氧刺激，腫瘤細胞需要分泌多種促血管生成因子促使血管生成才能繼續(xù)生長和轉(zhuǎn)移。其分泌的血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）被認為是腫瘤血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，靶向VEGF/VEGFR 信號軸已成為抗血管生成藥物發(fā)展的核心[41]。Zhao等[42]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能有效抑制小鼠Lewis肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，抑制其腫瘤組織中血管生成、VEGF 和表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）的蛋白表達，并具有濃度-效應(yīng)關(guān)系，提示APS可能通過降低VEGF 和EGFR 的表達，發(fā)揮抑制腫瘤作用。此外，鐵寶霞[43]研究顯示黃芪多糖能下調(diào)人結(jié)腸癌細胞LOVO的VEGF-C蛋白和mRNA的表達水平，增強正常人淋巴管內(nèi)皮HLEC 細胞的活性，提示其抗癌作用可能與淋巴管生成有一定關(guān)系。但關(guān)于黃芪多糖抗血管新生和淋巴管新生的進一步機制研究文獻報道尚不多，其作用機制待進一步深入研究。

3 增效減毒作用

黃芪多糖增強腫瘤細胞對化療藥的敏感性，張明明等[44]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖通過調(diào)控耐藥相關(guān)基因MDR1、xIAP 等的表達提高人胃癌細胞SGC7901對洛鉑的敏感性。翟秋麗等[45-46]研究表明黃芪多糖通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 增強卵巢癌細胞SKOV3 的自噬活性，從而增加SKVO3細胞對順鉑的敏感性；又可聯(lián)合順鉑協(xié)同增強宮頸癌細胞siha通過線粒體途徑發(fā)生的凋亡。

骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)是常見的化療的毒副反應(yīng)，嚴重影響患者的身體機能、生活質(zhì)量。石岳堅等[45]觀察彌漫大B細胞淋巴瘤患者使用RCHOP 化療方案聯(lián)合注射用黃芪多糖的療效，與單獨化療的對照組相比，治療組因化療所致的不良反應(yīng)、心臟毒性、免疫抑制、KPS評分等明顯改善。崔偉等[48]通過觀察僅接受新輔助化療TP方案和接受黃芪多糖聯(lián)合新輔助化療TP方案治療宮頸癌患者的近期療效、生活質(zhì)量、免疫功能和不良反應(yīng)等指標，結(jié)果顯示黃芪多糖除可改善療效、生活質(zhì)量，減輕不良反應(yīng)，還能降低外周血中免疫抑制細胞Tregs和MDSC的比例，說明黃芪多糖能緩解化療所致的不良反應(yīng)，增強患者免疫功能，改善生活質(zhì)量，使患者的化療耐受性提高，具有減毒增效的作用。此外，張明明等[49]觀察發(fā)現(xiàn)胃癌患者術(shù)后化療應(yīng)用黃芪多糖后，其IL-6、CRP、PCT、IL-10 水平及白細胞水平得到改善，炎癥反應(yīng)得到減輕，可有效緩解患者的易感狀態(tài)，對后期康復(fù)起到積極的作用。

4 小結(jié)與展望

黃芪多糖在調(diào)節(jié)腫瘤免疫方面能促進固有免疫、適應(yīng)性免疫間接殺傷腫瘤，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用；又可通過多種途徑直接抗腫瘤細胞；與其他化療藥物聯(lián)合使用，能增強療效又能減輕其毒副作用，促進患者預(yù)后康復(fù)。黃芪多糖作為天然植物的提取物，具有生物安全性良好、靶點多、作用范圍廣泛的特點，在新技術(shù)聯(lián)合[18]、創(chuàng)新劑型[50]等方面的應(yīng)用中顯示出獨特優(yōu)勢和巨大的潛力。然而，其結(jié)構(gòu)分析方面的研究，相較于藥理作用方面，略顯不足。對化學結(jié)構(gòu)充分分析，明確構(gòu)效關(guān)系，將有利于其在抗腫瘤研究的進一步開發(fā)應(yīng)用。