金 磊， 張子敬， 朱肖亭， 呂世杰， 黃永震， 王二耀， 徐照學(xué)， 施巧婷*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；3.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

1 抗氧化劑的分類(lèi)及功能

機(jī)體的正常生命活動(dòng)都在不斷產(chǎn)生自由基，正常情況下機(jī)體內(nèi)相應(yīng)抗氧化酶(超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶等)，可以清除一部分自由基，使氧化還原處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但在各種因素刺激下，如高氧、環(huán)境應(yīng)激等，自由基的清除就會(huì)遭到破壞，機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯。目前，用于清除自由基的抗氧化劑通常分為來(lái)自體內(nèi)的酶類(lèi)抗氧化劑和來(lái)自體外的非酶類(lèi)抗氧化劑兩類(lèi)。前者主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和過(guò)氧化物酶(POD)等；后者主要有維生素C、維生素E、谷胱甘肽(GSH)、白藜蘆醇、姜黃素、褪黑素、微量元素硒等。

2 酶類(lèi)抗氧化劑

2.1 超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是存在于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，它通過(guò)催化超氧陰離子自由基使其轉(zhuǎn)化成氧和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的催化下還原成水和氧氣，二者在機(jī)體的氧化和抗氧化平衡中起到重要作用， 并與許多疾病有著密切關(guān)系[5-6]。SOD催化中心含有1個(gè)金屬陽(yáng)離子，根據(jù)金屬離子的不同，SOD家族分為Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD和Ni-SOD 4種[7]。Cu/Zn-SOD和Mn-SOD在真原核生物中均有存在，F(xiàn)e-SOD主要存在于原核生物和植物的葉綠體中，目前只在鏈霉菌屬和藍(lán)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)Ni-SOD存在。Nagasaka等[8]研究表明，Cu/Zn-SOD增多會(huì)減輕因氧化物增加引起的肝損傷。馬瑛等[9]研究表明，在斑馬魚(yú)胚胎早期由于耗氧量低，SOD含量也較低；在胚胎中后期由于需氧量的增加，SOD含量升高從而清除過(guò)量的活性氧，防止ROS對(duì)遺傳物質(zhì)的毒害作用，保障胚胎能夠正常發(fā)育。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶可根據(jù)分子中是否含硒分為：硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Se-GSH-Px)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)，二者均可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫。在過(guò)氧化氫酶含量很少或H2O2量很少的組織中，如腦、精液，GSH-Px可代替過(guò)氧化氫酶清除組織中H2O2[10]。另有研究表明給小鼠腹腔注射谷胱甘肽活性酶抑制劑后可顯著降低小鼠胚胎的妊娠率[11]。

2.2 過(guò)氧化氫酶

過(guò)氧化氫酶可清除超氧化物歧化酶歧化超氧陰離子自由基(O2-)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫(H2O2)，保護(hù)并提高了SOD酶活性；還可清除從其他部位擴(kuò)散的H2O2，使其分解為水(H2O)和氧氣(O2)，從而使胚胎免于遭受 H2O2的毒害。Julia等[12]的研究表明，小鼠胚胎發(fā)育畸形率隨著過(guò)氧化氫酶活性的降低而增加，加入外源過(guò)氧化氫酶可以阻斷該現(xiàn)象。然而有研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)體內(nèi)過(guò)氧化氫酶濃度逐漸降低，妊娠率逐漸降低，但胚胎質(zhì)量與過(guò)氧化氫酶濃度無(wú)關(guān)[13]。Yasushi等[14]研究證實(shí)，在小鼠的體外胚胎培養(yǎng)中，事先對(duì)精子進(jìn)行過(guò)氧化氫酶預(yù)處理，處理組其囊胚率及孵化囊胚率顯著升高。

3 非酶類(lèi)抗氧化劑

3.1 維生素C和維生素E

維生素C(vitamin C，VC)又叫L-抗壞血酸，具有較強(qiáng)的抗氧化性，它可提供電子使Fe3+還原為Fe2+，后者可以維持膠原酶的活性而起到抗壞血病的作用；還可以使氧化型谷胱甘肽還原為還原型谷胱甘肽，后者可清除活性氧自由基，保護(hù)胚胎發(fā)育。據(jù)Hu等[15]的報(bào)道，在豬胚胎體外培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)加入VC(20 mg/mL)后胚胎內(nèi)ROS水平顯著下降，且囊胚率及囊胚細(xì)胞數(shù)顯著增加。說(shuō)明VC抑制了ROS對(duì)胚胎的毒性作用。然而Hossein等[16]研究結(jié)果顯示，一次性單獨(dú)添加VC并不會(huì)對(duì)豬胚胎的體外發(fā)育產(chǎn)生影響，當(dāng)分兩次進(jìn)行添加時(shí)囊胚率顯著升高。這有可能是因?yàn)榕咛グl(fā)育不同階段產(chǎn)生ROS的量以及對(duì)ROS的敏感性不同。研究證實(shí)，一定的VC還可以提高牛，羊卵母細(xì)胞的體外成熟率和卵裂率[17-18]。

維生素E(vitamin E，VE)是一種脂溶性抗氧化劑，主要保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損傷，提高胚胎發(fā)育能力。已被證實(shí)添加VE可以提高牛[19]、老鼠[20]、羊[21]、豬[22]等胚胎發(fā)育潛能。據(jù)報(bào)道VC還參與了VE的再生，保證了VE作為抗氧化劑可以被不斷重復(fù)使用，并通過(guò)和自由基反應(yīng)防止VE被氧化。然而據(jù)Dalvit等[23]報(bào)道，在牛的體外成熟培養(yǎng)液中同時(shí)添加VC和VE其囊胚率卻顯著低于單獨(dú)添加組，這和Hossein等[16]在豬上的研究結(jié)果相同，然而當(dāng)將VC和VE分2次添加(0和96 h)，其囊胚率與胚胎質(zhì)量顯著提高。

3.2 白藜蘆醇

白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的多酚類(lèi)化合物，具有細(xì)胞內(nèi)抗氧化功能。近年來(lái)，有關(guān)白藜蘆醇對(duì)胚胎體外發(fā)育的促進(jìn)作用得到越來(lái)越多的證實(shí)。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中加入白藜蘆醇提高了卵母細(xì)胞成熟率和體外受精囊胚率，并且其細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低。據(jù)Kwak等[25]的報(bào)道，在豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中添加2 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理可提高胚胎囊胚率以及胚胎發(fā)育潛力，并且抑制了Caspase-3的表達(dá)，降低了卵母細(xì)胞凋亡率，然而當(dāng)加入10 μmol/L白藜蘆醇，胚胎卵裂率和成熟率明顯降低。說(shuō)明白藜蘆醇的生物學(xué)作用具有劑量依賴性，濃度過(guò)高便會(huì)產(chǎn)生不利影響。Mukherjee等[26]研究表明，在山羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中添加白藜蘆醇可提高GSH水平，提高孤雌胚胎和克隆胚胎的發(fā)育潛力，說(shuō)明白藜蘆醇可通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，改善胚胎發(fā)育潛能。Daichi等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細(xì)胞成熟液中添加白藜蘆醇，可增強(qiáng)沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT1)的表達(dá)，使線粒體功能增強(qiáng)，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育。在牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中也得到相同結(jié)論[28]。

3.3 谷胱甘肽

谷胱甘肽(GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，是細(xì)胞內(nèi)一種重要的抗氧化物質(zhì)。GSH能維持卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中紡錘體的形態(tài)并防止其被氧化，對(duì)胚胎的后續(xù)發(fā)育起著重要作用。Timme-Laragy等[29]以斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯堪l(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，GSH與胚胎內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)，通過(guò)清除ROS來(lái)保護(hù)半胱氨酸免受氧化損傷，并且GSH還與胚胎代謝系統(tǒng)和DNA的甲基化有關(guān)。Zuelke等[30]在倉(cāng)鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，MⅡ期卵母細(xì)胞中每枚卵母細(xì)胞約含3.24 pmol/L的GSH，而在囊胚階段則僅有0.29 pmol/L，約占MⅡ期GSH含量的9%。說(shuō)明胚胎發(fā)育的不同階段GSH含量也呈現(xiàn)明顯差異，隨著分裂分化的進(jìn)行而逐漸降低。在豬胚胎體外培養(yǎng)中添加GSH，能夠有效促進(jìn)ICSI胚胎的卵裂率和囊胚率，并且囊胚凋亡細(xì)胞數(shù)顯著降低，提高了胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛力，同時(shí)也降低了胚胎內(nèi)源ROS，對(duì)胚胎起到很好地保護(hù)作用。在牛胚胎體外發(fā)育實(shí)驗(yàn)中也得到相同結(jié)果，但濃度過(guò)高則會(huì)產(chǎn)生不利影響[31-32]。據(jù)孫尉峻[33]研究報(bào)道，3 mmol/L為外源GSH在牛胚胎體外培養(yǎng)中最適添加濃度，能顯著提高囊胚發(fā)育率和早期囊胚總細(xì)胞數(shù)，并能夠促進(jìn)2-4細(xì)胞期胚胎內(nèi)源性GSH的增長(zhǎng)。而據(jù)李鳳[34]研究發(fā)現(xiàn)，外源GSH通過(guò)γ-谷氨酰循環(huán)促進(jìn)牛胚胎內(nèi)GSH的合成和胚胎的體外發(fā)育，并且GGT酶和GCL 酶在其中扮演了重要角色。

3.4 褪黑素

褪黑素(melatonin，MT)是一種具有抗氧化能力的胺類(lèi)激素，褪黑素可以激活MT1和MT2這兩種G蛋白偶聯(lián)受體，這兩種受體對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)具有調(diào)節(jié)作用。王淑娟等[35]在牛的胚胎體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加褪黑素可顯著提高卵母細(xì)胞成熟率和胚胎發(fā)育潛能，并且MT1受體的表達(dá)量隨胚胎的發(fā)育而升高。Zhao等[36]研究也有相同結(jié)論。MT作為一種有效的抗氧化劑可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，改善卵母細(xì)胞的體外成熟與胚胎的體外發(fā)育潛能。Gitto等[37]研究表明，與VA、VE和N-乙酰半胱氨酸相比，MT更有利于卵母細(xì)胞的成熟。有研究證實(shí)MT對(duì)小鼠[38]、豬[39]胚胎體外發(fā)育也具有顯著促進(jìn)作用。作為抗氧化劑，MT可以顯著減少體外培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，改善胚胎質(zhì)量。有研究證實(shí)，MT可抑制綿羊顆粒細(xì)胞在熱應(yīng)激情況下引起的增殖減少和凋亡率增加[40]。Su等[41]研究表明，MT可抑制促凋亡基因p53和Bax的表達(dá)，并促進(jìn)抗氧化基因SOD1和Gpx4，抗凋亡基因BCL2L1和多能性相關(guān)基因SOX2在胚胎中的表達(dá)。

4 小 結(jié)

卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的氧化和還原平衡對(duì)其發(fā)育至關(guān)重要，在體外培養(yǎng)中這種平衡很容易被打破，所以需要加入相關(guān)抗氧化物質(zhì)以減少ROS對(duì)胚胎造成氧化損傷。了解胚胎的抗氧化機(jī)制也有助于培養(yǎng)液的優(yōu)化，從而提高卵母細(xì)胞體外成熟率和胚胎發(fā)育潛能，為胚胎體外生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。