李洋洋 張苡銘 魏孔熙 周婷 何進鵬 丁楠 周谷城 史桐凡 柯宜誠 牛帆 劉永琦 張利英

摘 要 目的：比較黃芪不同有效成分對電離輻射致人骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）DNA損傷的防護作用。方法：采用2 Gy X射線直接輻照BMSCs建立輻射細胞模型。采用CCK-8法檢測不同質(zhì)量濃度（25、50、75、100 μg/mL）黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮輻射前干預(yù)1 d+輻射后干預(yù)1～5 d對輻射BMSCs增殖的影響，篩選給藥濃度和輻射后繼續(xù)干預(yù)時間。將輻射BMSCs分為輻射組、黃芪多糖組、黃芪皂苷組、黃芪黃酮組，后3組輻射前后均使用適宜的相應(yīng)藥物進行干預(yù)，另設(shè)空白組進行比較;采用胞漿分裂阻滯微核法檢測輻射后干預(yù)適宜時間的微核細胞率和細胞微核率，免疫熒光法檢測輻射后干預(yù)適宜時間細胞中53BP1焦點簇數(shù)量，并對不同時間點（0.5、2、12、24 h）的53BP1焦點簇數(shù)量進行比較。結(jié)果：與空白組比較，輻射組BMSCs的OD值顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與輻射組比較，50 μg/mL黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮繼續(xù)干預(yù)2～3 d時BMSCs的OD值均顯著升高，其余劑量組僅部分時間點有顯著差異（P<0.05或P<0.01）;綜合考慮確定給藥濃度為50 μg/mL，輻射后繼續(xù)干預(yù)時間為2 d。與空白組比較，輻射組、黃芪多糖組、黃芪皂苷組、黃芪黃酮組微核細胞率和細胞微核率均顯著升高，輻射組和黃芪多糖組細胞中53BP1焦點簇數(shù)量均顯著增加（P<0.01）。與輻射組和黃芪黃酮組比較，黃芪多糖組和黃芪皂苷組微核細胞率、細胞微核率和53BP1焦點簇數(shù)量（輻射后干預(yù)0.5、2、12 h）均顯著降低或減少，且黃芪多糖組微核細胞率和細胞微核率均顯著低于黃芪皂苷組（P<0.05）;超過24 h檢測不出53BP1焦點簇。結(jié)論：黃芪多糖和黃芪皂苷對輻射所致的BMSCs DNA損傷均有防護作用，其中黃芪多糖防護效果優(yōu)于黃芪皂苷;黃芪黃酮對輻射所致的DNA損傷無防護作用。

關(guān)鍵詞 黃芪多糖;黃芪黃酮;黃芪皂苷;電離輻射;骨髓間充質(zhì)干細胞;DNA損傷

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To compare the protective effects of different effective components of Astragali radix against DNA damage of human bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） induced by ionizing radiation. METHODS： 2 Gy X-rays were used to directly irradiate BMSCs to establish a radiation model. CCK-8 method was used to detect the effects of different mass concentrations （25， 50， 75， 100 μg/mL） of astragalus polysaccharide， astragalus saponin and astragalus flavonoids for 1 day before radiation + 1 to 5 days after radiation on the proliferation of BMSCs. The dose concentration and the duration of intervention after radiation were selected. The irradiated BMSCs were divided into radiation group， astragalus polysaccharide group， astragalus saponin group and astragalus flavonoids group. The last three groups were treated with appropriate dosage of corresponding drugs before and 2 days after radiation， and a blank group was set for comparison. Cytoplasmic division arrest micronucleus method was used to detect micronucleus cell rate and cell micronucleus rate after appropriate time of intervention following radiation; immunofluorescence method was used to detect the number of 53BP1 foci in cells after appropriare time of intervention following radiation; the number of 53BP1 foci were compared among different time points （0.5， 2， 12， 24 h）. RESULTS： Compared with blank group， OD values of BMSCs were decreased significantly in radiation group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with radiation group， the OD values of BMSCs were significantly increased when 50 μg/mL astragalus polysaccharide， astragalus saponin and astragalus flavonoids continuously intervened radiation for 2-3 days， there was significant difference in other groups at some time point （P<0.05 or P<0.01）. After consideration， drug concentration was determined to be 50 μg/mL， and the continuous intervention time was 2 days after radiation. Compared with blank group， the micronucleus cell rate and cell micronucleus rate of radiation group， astragalus polysaccharide group， astragalus saponin group and astragalus flavonoids group increased significantly， and the number of 53BP1 focus cluster in radiation group and astragalus polysaccharide group increased significantly （P<0.01）. Compared with radiation group and astragalus flavonoids group， the micronucleus cell rate， cell micronucleus rate and the number of 53BP1 focus cluster （continued intervention for 0.5， 2， 12 h） in the astragalus polysaccharide group and astragalus saponin group were significantly reduced， and the micronucleus cell rate and cell micronucleus rate in the astragalus polysaccharide group were significantly lower than astragalus saponin group （P<0.05）. 53BP1 focus cluster could not be detected 24 h later （P<0.05）. CONCLUSIONS： Astragalus polysaccharide and astragalus saponin both have protective effects on BMSCs DNA damage induced by radiation， and the protective effect of astragalus polysaccharide is better than that of astragalus saponin; astragalus flavonoids has no protective effect on radiation-induced DNA damage.

KEYWORDS ? Astragalus polysaccharide; Astragalus flavonoids; Astragalus saponin; Ionizing radiation; Bone marrow mesenchymal stem cells; DNA damage

放療是惡性腫瘤的主要治療手段之一，放療在殺傷腫瘤組織的同時，不可避免地會對正常組織造成損傷，產(chǎn)生放療毒性[1-2]。已有研究表明，電離輻射（Ionizing radiation，IR）可通過多種機制破壞細胞，其中最重要的是造成細胞DNA損傷，當損傷無法修復(fù)時，則可引發(fā)細胞癌變[3]。骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有自我更新和多向分化潛能的細胞，參與多種組織的修復(fù)。當輻射腫瘤組織時，該組織周圍會聚集大量的BMSCs;受輻射影響，BMSCs可引發(fā)多種生物學(xué)反應(yīng)，包括活性氧（ROS）生成、細胞凋亡和增殖抑制等，甚至?xí)l(fā)生BMSCs惡性轉(zhuǎn)化[4]。研究表明，IR會誘導(dǎo)BMSCs DNA損傷，其中細胞凋亡、細胞周期紊亂、衰老和細胞因子分泌等分子機制均可影響B(tài)MSCs的輻射反應(yīng)[5]，因此，防護IR致BMSCs DNA損傷至關(guān)重要。中醫(yī)認為，輻射可導(dǎo)致機體耗氣傷陰，而運用補氣類中藥黃芪可有效改善輻射導(dǎo)致的細胞損傷[6]。黃芪最主要的活性成分為黃芪多糖、黃芪皂苷和黃芪黃酮，研究表明其具有增強機體免疫、抗應(yīng)激、抗腫瘤、延緩衰老、抗輻射等多種藥理作用[7]，但目前尚不明確何種成分可以有效改善IR所造成的DNA損傷。基于此，本研究擬著重比較黃芪的3種主要活性成分黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮對IR致BMSCs DNA損傷的防護作用，旨在為臨床BMSCs的輻射防護用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）;X-RAD225型X射線輻射儀（美國Faxitron公司）;Infinite M200 Pro型全波長酶標儀（瑞士Tecan公司）;BX51TRF型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;SKY- 111Z型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為ZD1219LA18、B20563、J20F7T9819，均為混合物）;0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司，批號：J150037）;CCK-8試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司，批號：JQ878）;4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，上海浩然生物技術(shù)有限公司，批號：H-1200）;兔源p53結(jié)合蛋白1（53BP1）多克隆抗體、山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（DyLight? 594）二抗（美國Abcam公司，批號分別為GR89172-5、G1101）;細胞松弛素B和吖啶橙染料（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為C8080、A8120）、Triton-X 100試劑（上海生工生物工程股份有限公司，批號：0694）;卡諾固定液（實驗室自制）;其余試劑均為實驗室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細胞

人源BMSCs（批號：7500）及其專用培養(yǎng)基（批號：0074）均購自美國ScienCel公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

用專用培養(yǎng)基將BMSCs接種于60 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細胞融合度達到85%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第5代細胞用于試驗。

2.2 輻射細胞模型建立

用X射線直接輻照BMSCs建立輻射模型，劑量率為200 cGy/min（225.0 kV，13.3 mA），總劑量2 Gy，時間1 min，距輻射源距離為70 cm。

2.3 含藥培養(yǎng)基制備

黃芪多糖、黃芪皂苷和黃芪黃酮分別用專用培養(yǎng)基溶解，具體方法為：取相應(yīng)藥物20 mg，分別溶于專用培養(yǎng)基20 mL中，使其質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL，再分別用專用培養(yǎng)基進行稀釋，使其質(zhì)量濃度分別均為100、75、50、25 μg/mL。

2.4 細胞增殖能力檢測

采用CCK-8法檢測。收集對數(shù)生長期的BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后，以專用培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按100 μL/孔（即2×103個/孔）接種于5個96孔板中，將細胞隨機分為空白組、輻射組、黃芪多糖組、黃芪皂苷組、黃芪黃酮組。待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，各藥物組分別加入含不同質(zhì)量濃度（25、50、75、100 μg/mL，濃度按前期預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置）黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮的專用培養(yǎng)基100 μL，空白組和模型組加入專用培養(yǎng)基100 μL，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。預(yù)干預(yù)培養(yǎng)1 d后，吸棄培養(yǎng)基50 μL，空白組用0.3 mm厚的鉛板擋住，其余各組用X射線按“2.2”項下條件進行直接照射，照射后棄剩余培養(yǎng)基，重新加入上述相應(yīng)不含藥或含藥的專用培養(yǎng)基100 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)干預(yù)。分別于繼續(xù)干預(yù)1、2、3、4、5 d時按CCK-8試劑盒說明書操作，使用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值。試驗重復(fù)3次，根據(jù)OD值選取后續(xù)試驗黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮的給藥濃度和輻射后繼續(xù)干預(yù)時間。

2.5 細胞微核形成情況檢測

采用胞漿分裂阻滯微核法檢測。收集對數(shù)生長期的BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后，以專用培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按1 mL/孔（即1×104個/孔）接種于24孔板中，將細胞隨機分為空白組、輻射組、黃芪多糖組、黃芪皂苷組、黃芪黃酮組，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細胞貼壁后，按“2.4”項下方法加藥、預(yù)干預(yù)、輻射，重新加入專用培養(yǎng)液后，繼續(xù)干預(yù)（藥物組的給藥濃度和繼續(xù)干預(yù)時間均參考“2.4”項下結(jié)果）。各組細胞加入1 mg/mL的細胞松弛素B 1 μL，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）洗兩次，在通風櫥中用卡諾固定液固定30 min，棄去固定液，反扣培養(yǎng)皿，在通風櫥中干燥30 min，用吖啶橙染料染色30 s。用熒光顯微鏡觀察記錄1 000個雙核細胞中有微核的細胞數(shù)量和1 000個雙核細胞中微核的總數(shù)量（微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外），計算微核細胞率和細胞微核率，以千分率（‰）表示，微核細胞率=（帶微核的細胞總數(shù)/總的雙核細胞數(shù)）×1 000‰，細胞微核率=（微核總數(shù)目/總的雙核細胞數(shù)）×1 000‰。試驗重復(fù)3次。

2.6 細胞中53BP1焦點簇數(shù)量的檢測

采用免疫熒光法檢測。取無菌的12孔板，每孔加入20 mm×20 mm已滅菌蓋玻片，用紫外線照射1 h。取對數(shù)生長期BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后，以專用培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按2 mL/孔（即4×103個/mL）接種于上述12孔板中，將細胞隨機分為空白組、輻射組、黃芪多糖組、黃芪皂苷組、黃芪黃酮組，每組設(shè)3個復(fù)孔。按“2.5”項下方法加藥、預(yù)干預(yù)、輻射、繼續(xù)干預(yù)適宜時間（參考“2.4”項下結(jié)果初設(shè)繼續(xù)干預(yù)時間，再根據(jù)檢測結(jié)果細分干預(yù)時間，即繼續(xù)干預(yù)0.5、2、12、24 h）。棄去培養(yǎng)基，細胞用4 ℃甲醇固定20 min后，于0.5%Triton-X 100試劑孵育10 min;用5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入53BP1抗（稀釋比例為1 ∶ 500），室溫孵育2 h，以PBST溶液洗滌3次，再加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h，以PBST溶液洗滌5次。細胞核以DAPI進行復(fù)染并制片，使用熒光顯微鏡觀察并拍照，每個樣品計數(shù)100個細胞并計算其中53BP1焦點簇數(shù)量（53BP1蛋白顯紅色熒光）。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk檢驗進行正態(tài)性檢驗。計量資料符合正態(tài)分布者以x±s表示，不符合正態(tài)分布者以M（P25，P75）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組比較前者采用Students t檢驗，后者采用秩和檢驗。計數(shù)資料以千分率表示，采用秩和檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮對BMSCs增殖的影響

不同質(zhì)量濃度黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮繼續(xù)干預(yù)不同時間對BMSCs增殖的影響結(jié)果見表1～表3。

表1～表3結(jié)果顯示，與空白組比較，輻射組各時間點的OD值顯著降低，提示BMSCs增殖受到明顯抑制（P<0.05或P<0.01）。與輻射組比較，25 μg/mL黃芪多糖繼續(xù)干預(yù)2 d，25 μg/mL黃芪皂苷繼續(xù)干預(yù)1～3 d，25 μg/mL黃芪黃酮繼續(xù)干預(yù)2～3 d，50 μg/mL黃芪多糖繼續(xù)干預(yù)1～5 d，50 μg/mL黃芪皂苷、黃芪黃酮繼續(xù)干預(yù)2～4 d，75 μg/mL黃芪多糖、黃芪皂苷繼續(xù)干預(yù)2 d時BMSCs的OD值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。綜合考慮BMSCs的生長狀況，將后續(xù)試驗的藥物濃度確定為50 μg/mL，輻射后繼續(xù)干預(yù)時間確定為2 d。

3.2 黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮對BMSCs細胞微核形成的影響

與空白組比較，輻射組、黃芪多糖組、黃芪皂苷組、黃芪黃酮組微核細胞率和細胞微核率均顯著升高（P<0.01）。與輻射組和黃芪黃酮組比較，黃芪多糖組和黃芪皂苷組微核細胞率和細胞微核率均顯著降低，且黃芪多糖組顯著低于黃芪皂苷組（P<0.05）。各組微核細胞熒光顯微圖見圖1，微核細胞率和細胞微核率的檢測結(jié)果見圖2。

3.3 黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮對BMSCs中53BP1焦點簇數(shù)量的影響

隨著繼續(xù)干預(yù)時間的延長，BMSCs中53BP1焦點簇數(shù)量逐漸減少，超過24 h已基本檢測不出結(jié)果，故重點分析繼續(xù)干預(yù)0.5、2、12、24 h時53BP1焦點簇數(shù)量的變化。與空白組比較，輻射組和黃芪多糖組細胞中53BP1焦點簇數(shù)量均顯著增加（P<0.01）。與輻射組和黃芪黃酮組比較，黃芪多糖組繼續(xù)干預(yù)0.5、2、12、24 h（與黃芪黃酮組比較除外）和黃芪皂苷組繼續(xù)干預(yù)0.5、2、12時細胞中53BP1焦點簇數(shù)量均顯著減少（P<0.05），而黃芪多糖組和黃芪皂苷組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組繼續(xù)干預(yù)0.5 h時細胞中53BP1焦點簇的熒光顯微圖見圖3（圖中，DAPI表示細胞核，53BP1表示53BP1蛋白），53BP1焦點簇數(shù)量的檢測結(jié)果見圖4。

4 討論

放療是惡性腫瘤的關(guān)鍵治療手段，然而其對周圍組織造成的損傷也不容忽視。放療在治療惡性腫瘤的同時，也有諸多副作用，例如其所導(dǎo)致的造血系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng)，且隨著輻射劑量的增加，毒副反應(yīng)相應(yīng)增加[8]。已有研究表明，化療毒副反應(yīng)的罪魁禍首即細胞DNA損傷，Smith TA等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的IR即可導(dǎo)致細胞DNA損傷，產(chǎn)生大量ROS和自由基，導(dǎo)致細胞基因組不穩(wěn)定，從而引起細胞凋亡、壞死，甚至癌變。BMSCs是具有自我更新和多向分化潛能的細胞。正常情況下，BMSCs可以對惡性腫瘤所導(dǎo)致的炎癥微環(huán)境進行損傷修復(fù);但當受到輻射時，BMSCs會受到輻射副作用的影響，從而抑制細胞增殖，引起細胞凋亡，甚至癌變[9]。Thomas JG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤放療后可增強BMSCs的定位，其中趨化因子CCL2在IR誘導(dǎo)BMSCs向膠質(zhì)瘤的定向中起著重要作用。因此，DNA損傷為輻射副作用致BMSCs癌變的罪魁禍首。由此可見，防護輻射所致的BMSCs DNA損傷具有重要的臨床意義。

DNA損傷的兩個關(guān)鍵指標為微核的產(chǎn)生和DNA雙鏈的斷裂。微核也叫微衛(wèi)星，是由斷裂的染色體片段或染色體形成的，其出現(xiàn)通常是遺傳毒性事件發(fā)生的標志，細胞微核率可反映染色體DNA損傷程度[11]。DNA雙鏈斷裂是細胞暴露于IR后最重要的DNA損傷。細胞DNA雙鏈斷裂后，很快誘發(fā)組蛋白γH2AX的第139位絲氨酸磷酸化為53BP1，53BP1對于募集其他DNA損傷修復(fù)反應(yīng)蛋白到DNA損傷位點處進行DNA損傷修復(fù)起著非常關(guān)鍵的作用，其焦點簇數(shù)量能夠反映輻射損傷的水平，是評價DNA雙鏈斷裂的重要指標[12-13]。本研究結(jié)果顯示，進行IR之后，BMSCs微核細胞率和細胞微核率均顯著升高，這與已有研究[14]報道結(jié)果一致。

中醫(yī)將IR命名為新型毒邪——電離毒，兼具火熱之性，可耗氣傷津，使人體正氣虧虛，故補氣生津應(yīng)為輻射防護的主要治則[15]。中藥黃芪為補氣生津的代表，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表等功效，是我國傳統(tǒng)的補氣中藥材之一。黃芪主要活性成分為多糖、皂苷和黃酮等，具有增強機體免疫、造血功能、抗應(yīng)激、抗腫瘤、延緩衰老、抗輻射、抗菌、抗病毒等多種藥理作用[7]。但黃芪是由多種成分共同構(gòu)成的，尚不清楚哪一種成分防護IR的效果更好。本研究通過CCK-8法檢測不同質(zhì)量濃度黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮對BMSCs增殖的影響，結(jié)果顯示，50 μg/mL黃芪多糖、黃芪皂苷和黃芪黃酮對輻射BMSCs進行干預(yù)后均可明顯促進BMSCs的增殖。用50 μg/mL黃芪多糖和黃芪皂苷對輻射BMSCs繼續(xù)干預(yù)2 d或24 h后，BMSCs的微核細胞率、細胞微核率和53BP1焦點簇數(shù)量均顯著減少且黃芪多糖組的微核細胞率、細胞微核率均顯著低于黃芪皂苷組;而50 μg/mL黃芪黃酮干預(yù)則對微核細胞率、細胞微核率和53BP1焦點簇數(shù)量無顯著影響。由此表明，黃芪多糖和黃芪皂苷對輻射所致的DNA損傷均有防護作用，其中黃芪多糖的防護效果優(yōu)于黃芪皂苷;而黃芪黃酮對輻射所致的DNA損傷無防護作用。其中，黃芪多糖對IR的防護作用與文獻報道結(jié)果[16-19]一致。本研究結(jié)果為黃芪有效成分防護IR所致BMSCs DNA損傷的應(yīng)用提供了選擇依據(jù)，為臨床輻射防護奠定了理論基礎(chǔ)，但是關(guān)于具體的防護作用機制尚不明確，后續(xù)仍需進一步探討。

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（收稿日期：2020-09-16 修回日期：2020-10-29）

（編輯：鄒麗娟）