于 翔，王晨柳，文逸凡，張子敬，呂世杰，王二耀，黃永震*

(1.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 鄭州 450003；2.西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；3.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 45002；

1 DNA甲基化概述

表觀遺傳是指在堿基排序順序沒有改變的前提下所發(fā)生的外部表型特征和內部生理生化特征的改變，同時這種改變是可遺傳給后代的。DNA甲基化是表觀遺傳的一種重要形式，而在動物機體內，其他形式的表觀遺傳還包括組蛋白修飾、非編碼RNA和染色質重塑。在真核生物中，常常需要借助DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)來完成甲基化的甲基轉移過程，被轉移的甲基基團來源于S-腺苷提供甲硫氨酸，整個反應最終使DNA分子上CpG二核苷酸位點的胞嘧啶被修飾為5-甲基胞嘧啶(5-mC)，完成DNA分子的甲基化。

在哺乳動物中，參與甲基化修飾過程的轉移酶主要是DNMT1和DNMT3(DNMT3a、DNMT3b)。前者發(fā)揮其功能，負責維持現有DNA的原有甲基化狀態(tài)；后者則在DNA重新甲基化發(fā)揮其功能，在細胞分化發(fā)育早期參與DNA共價修飾過程。而近年來，越來越多的研究表明，由DNA甲基化所引起的表觀遺傳對于動物的抗病性能[1]、生長發(fā)育[2-3]、繁殖性能[4]等方面均有重要的影響，因而相關位點的甲基化可作為分子標記，應用于未來的動物育種之中，本文將對此進行綜述。

2 甲基化與動物抗病性

動物抗病性是動物免疫功能的外在體現，分為兩個方面，包括動物體對病原侵入的忍耐能力和縮短病原的生活周期、抵御其帶來損傷的能力?？共⌒栽诓煌瑒游飩€體之間具有較大的差異，但能穩(wěn)定遺傳給后代[5]。動物免疫機制可分為兩大類，包括體液免疫和細胞免疫。而在細胞免疫過程中，成熟T淋巴細胞發(fā)揮著清除病原的重要作用。根據表面標志的不同和細胞功能的差異，T淋巴細胞又可細分為CD4+輔助T細胞和CD8+細胞毒性T細胞。CD4+輔助T細胞是一類非常重要的免疫細胞，它不僅在輔助CD8+T細胞發(fā)揮其功能的過程中扮演了重要角色，自身產生和分泌細胞因子也能夠使機體的免疫應答過程得到進一步的強化，細胞本身對于侵入機體的病原還具有不可忽視的殺滅和清除的功能[6]。

在實驗中發(fā)現，在因感染金黃色葡萄球菌而出現乳房炎的牛群中，體內CD4+T細胞的數量出現了較大的增長，結果遠高于未感染牛群，增長的CD4+細胞進而導致CD4+/CD8+T細胞的比值也出現了顯著下降[7]。而因在感染鏈球菌而患有乳房炎時這兩種免疫細胞則呈現出同步增長的趨勢。在一例針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究中也發(fā)現，在以病毒入侵為始，病毒感染宿主豬的不同時期中，豬體內的CD4+T細胞的數量呈現出了一個動態(tài)的變化過程[8]。而在對于復發(fā)性葡萄膜炎發(fā)病過程的研究中，馬對于該病的自發(fā)免疫能力也與CD4細胞膜蛋白組豐度顯著相關[9]。

而CD4基因與T淋巴細胞的分化和成熟密不可分，不同的表觀修飾會對T細胞的分化過程產生非常重要的影響，而CD4基因上的特性DNA位點的甲基化則與CD基因表達存在明顯的相關性[10]。研究發(fā)現，CD4基因的第一外顯子持續(xù)不斷的發(fā)生去甲基化時，對于CD4基因的整體表達能夠起到促進作用，同時也促進了雙陰性(Double—negative，DN)細胞發(fā)育為雙陽性(Double—postive，DP)細胞。在這個轉化過程中，該基因的甲基化程度經歷了一個先升高再降低的過程[11]，隨后完成轉化的雙陽性細胞繼續(xù)發(fā)育為CD4單陽性(CD4 single—positive，CD4SP)T 細胞[12]，繼續(xù)發(fā)揮其免疫功能。

研究還顯示，DNA甲基化與炎癥的發(fā)生也存在一定的關系[13]，甲基化能夠對炎癥反應產生一定的調控作用。機體內部分炎性因子啟動子區(qū)域內的甲基化水平能夠對炎性因子的總表達量產生不可忽視的影響作用；另外，某些炎性因子也能夠通過干擾甲基轉移酶，使其過量表達，從而導致DNA分子出現異常甲基化[14-15]。盡管在某些疾病中，DNA甲基化如何參與調控炎性因子的機制得到了初步揭示，發(fā)現了甲基化在調控炎癥的過程中的部分信號通路和調控途徑的作用過程，但仍有大量的調控機制有待于之后更深入的研究和解析。

近年來頻發(fā)的大規(guī)模流行疾病對畜牧業(yè)造成的損失巨大，加之在對牛、羊、豬等家畜的抗病性能評估上發(fā)現，家畜本土品種的抗病性能顯著優(yōu)于目前分布較廣、數量較多的培育品種[16-18]，因而開展了對家畜抗病性能遺傳基礎的研究熱潮。通過研究CD4基因的多態(tài)性和表觀遺傳進展，目前已經在牛、豬上闡明了CD4基因甲基化對于乳房炎等幾種特定疾病的抗病機制，但對于甲基化提高一般抗病力的研究以及應用于分子育種方面的研究尚不明確，也不深刻。且甲基化與抗病性能的研究多集中于牛、豬等家畜，對于羊等其他家畜的相關研究較少，期待后續(xù)更全面、更深入的研究。免疫相關基因的甲基化能夠作為動物抗病育種的分子理論基礎，再結合現代分子標記技術，將能夠大幅度提高抗病育種效率，培育出更好優(yōu)良的抗病家畜品種。

3 甲基化與動物生長發(fā)育

3.1 甲基化對肌肉發(fā)育的影響

動物的肌肉的發(fā)育是一個非常復雜的過程，位于中胚層的祖細胞，需要經過增殖、分化、融合及成熟等一系列的變化，最終才能形成肌纖維，完成肌肉發(fā)育。而在這個不斷變化的過程中，動物體內相關基因的甲基化狀態(tài)也呈現出了動態(tài)的變化趨勢，其過程十分復雜。細胞分化使細胞整體的甲基化狀態(tài)上升[19]，但在某些特殊位點上卻出現了下降。而研究發(fā)現，在骨骼肌細胞的形成過程中，是與其他組織或細胞的DNA甲基化模式存在有明顯差異的。Calvanese等發(fā)現在骨骼肌細胞能存在有至少178個特異的高甲基化位點[20]。Tsumagari等也通過比較發(fā)現在這些差異化位點中，有94%在肌肉中都表現為低甲基化，在成肌細胞或肌管細胞能夠發(fā)現的相同的位點占到了47%[21]。而肌肉的生長發(fā)育，與這些特異化的甲基化位點具有密切的關系。在這個過程中，兩類因子，即生肌調控因子(Myf5、Myf6、MyoD、MyoG)和調控因子上游的Pax3和Pax7等對肌肉具有非常重要而深遠的調控作用。通過比較胚胎干細胞、骨骼肌干細胞、成肌細胞及肌管細胞生肌調控因子相關基因的甲基化程度，Carrio等[22]發(fā)現，Myf5的增強子區(qū)域在胚胎干細胞中，該區(qū)域表現為高甲基化，而其他細胞均呈現出低甲基化，這種低甲基化水平使得Myf5基因表達量有所增加。這說明肌肉發(fā)育過程的甲基化模式具有一定的時空特異性，在不同生肌階段，甲基化狀態(tài)會產生一定的變化，這種甲基化狀態(tài)的變化能夠通過調控不同階段的基因表達，從而保證肌肉發(fā)育的正常進行。

3.2 甲基化對脂肪生長的影響

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是動物體內控制脂肪生成和脂肪組織發(fā)育的關鍵調控因子，同時也會參與糖脂代謝、炎癥、免疫反應等多種生理生化過程之中[23-25]。通過使PPARγ基因過表達能夠改變細胞分化方向，使非脂肪源性的細胞分化成為脂肪細胞[26]；而敲除 PPARγ基因后則脂肪細胞不能完成分化[27-28]。小鼠實驗中，在前脂肪細胞逐漸轉化為脂肪細胞的過程中，PPARγ2啟動子呈現出了由高甲基化逐漸向低甲基化發(fā)展的趨勢，而在這一過程中PPARγ2 mRNA的表達量則出現了逐漸上升[29]。在對患有肥胖型糖尿病的小鼠內臟脂肪細胞檢測的結果也佐證了這點，其PPARγ2啟動子的甲基化高于野生正常小鼠，進而導致PPARγ2 的mRNA表達量下降，因此對脂肪細胞的生成具有促進作用。Sun等[30]在高、低脂雙向選擇系肉雞 PPARγ基因啟動子6個位點甲基化及PPARγ表達量的實驗也證明DNA 甲基化能夠調控PPARγ基因的表達和脂肪生成。因此能夠把PPARγ基因視為一個遺傳標記和表觀遺傳標記，并將其應用于分子標記育種的潛力巨大，通過對PPARγ基因的篩選，能夠在一定程度評定動物個體或品種的生脂能力，進而加快優(yōu)質低脂畜禽品種培育進展。

4 甲基化與動物繁殖

初情期對于動物生長和畜產品生產是一個非常關鍵的時期，進入初情期的動物開始逐步獲得繁殖能力，其標志是母畜初次發(fā)情并排卵、公畜睪丸開始具備分泌和產生有功能的精子。關于初情期是如何啟動的，大多數的觀點贊成它是受到了多方面因素之間的交互作用的調控，主要的影響因素有遺傳、環(huán)境、神經內分泌等[31]，其出現時間早晚體現出了不同動物個體之間繁殖性能的相對差異。有研究顯示，在初情期的啟動過程中，大量的基因通過參與和調控神經內分泌，最終影響了初情期的啟動[32-34]。Elks等[35]研究發(fā)現，與人類的月經初潮年齡存在有一定關聯性的基因變異的數量已經超過了30種。而對靈長目動物獼猴的研究中發(fā)現，少年期和成年期雄性獼猴相比，成年猴腦組織的GnRH mRNA 的表達量更大，二者相比較有一個顯著增高，與此同時多個相關CpG島的甲基化狀態(tài)則表現為顯著的降低[36]。在一例向實驗動物注射了DNA甲基化抑制劑的對比的實驗中，注射了AZA的雌鼠和未注射雌鼠的初情期和性成熟時期出現了明顯的差異，注射了抑制劑后，初情期和性成熟時期表現出了明顯的推后[37]。在家畜中的研究發(fā)現，分別在1、2、3月齡對三元雜交豬(皮特蘭X長白豬X大白豬)8個已被證實的睪丸印記基因甲基化狀況進行檢測，發(fā)現這些基因仍然具有一定的活性，機體通過甲基化的形式，對印記基因發(fā)揮了一定的調控作用[38]。但甲基化究竟如何對動物繁殖產生影響，這其中的具體機制尚有待于研究闡明，目前在其他家畜上的研究和相關的報道仍然較少，仍需要后期進一步的研究。

5 小結

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳機制，其產生與變化會對動物的表型特征和生理生化特征產生巨大而深遠的影響。而目前針對甲基化的研究尚且停留在一個比較初級的階段，對于甲基化如何對動物產生影響的機制尚有待于進一步研究，應用于動物育種的研究報道也較少。但研究清楚甲基化的內在調控機制和外在表現過程，將有助于為開展分子標記輔助選育奠定扎實的理論基礎，進而指導培育高產、抗病、品質優(yōu)良的新品種，能夠更充分的發(fā)揮家畜的生產潛力，以得到更高的經濟效益。