劉 勛，姚小平，王艷領，彭 榮

(重慶工貿(mào)職業(yè)技術學院 生物化學工程系，重慶 408000)

氨基酸可作為營養(yǎng)物質(zhì)、藥物及化工原料。蛋白質(zhì)水解提取法是生產(chǎn)氨基酸的一種重要方法[1-7]。以動物毛發(fā)(人發(fā)、豬毛、鴨毛、雞毛等)為原料的氨基酸生產(chǎn)工藝已在工業(yè)上廣泛應用，提取的品種已從單一的胱氨酸到同時提取胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸等多種氨基酸[8-14]。從毛發(fā)中提取氨基酸的傳統(tǒng)工藝流程如下：

其中胱氨酸和酪氨酸是采用中和沉淀法分離，精氨酸一般采用離子交換樹脂法分離[11]，亮氨酸一般采用二甲苯磺酸沉淀法分離[12-14]。

作者提出了一條新的生產(chǎn)工藝[15]，基本工藝流程如下：

二氯苯磺酸與二甲苯磺酸結構相似，前者苯環(huán)上有兩個氯原子，后者苯環(huán)上有兩個甲基。它們都是高效的氨基酸沉淀劑。二甲苯磺酸只能沉淀亮氨酸，二氯苯磺酸既能沉淀亮氨酸，也能沉淀精氨酸。在新工藝中使用二氯苯磺酸為沉淀劑，從毛發(fā)水解液中選擇性地分步沉淀亮氨酸和精氨酸。沉淀亮氨酸、精氨酸后的母液可繼續(xù)分離提取胱氨酸和酪氨酸。新工藝簡化了工藝流程，大幅度提高了亮氨酸、精氨酸的收得率，方便了母液的綜合利用，減輕了環(huán)境污染。

二氯苯磺酸從水解液中沉淀亮氨酸得到二氯苯磺酸-亮氨酸復合物。但由于水解液中成分復雜，且沉淀有很強的夾帶與吸附效應，導致從水解液中得到二氯苯磺酸-亮氨酸復合物沉淀純度較低，需進一步提純。本文研究了二氯苯磺酸-亮氨酸復合物提純的方法。

為制備亮氨酸產(chǎn)品，還需將二氯苯磺酸除去或分離。可以借鑒的是二甲苯磺酸-亮氨酸復合物的分離方法[13,14]，采用的方法是在氨性溶液中加熱，再冷卻，亮氨酸形成結晶析出，二甲苯磺酸陰離子與銨離子溶解在溶液中。但這一方法在二氯苯磺酸-亮氨酸復合物的分離中并不適合。因為二氯苯磺酸銨在水中的溶解度較小，在同樣的條件下，二氯苯磺酸銨與亮氨酸同時析出結晶，無法實現(xiàn)二者的分離。

作者提出了一種利用鋇鹽與二氯苯磺酸形成難溶沉淀的新方法，實現(xiàn)了二氯苯磺酸與亮氨酸分離，最終得到符合質(zhì)量要求的亮氨酸產(chǎn)品。

1 實驗材料與方法

1.1 原材料、試劑和儀器

毛發(fā)：實驗中采用鴨毛為原料，羅江晨明生化制品有限公司提供。工業(yè)鹽酸：含31% HCl，工業(yè)級，用于水解鴨毛。其它化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-85C旋轉蒸發(fā)器：上海青浦滬西儀器廠；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；85-2磁力攪拌器：江蘇金壇大地自動化儀器廠；SHA-B恒溫水浴振蕩器：金壇實驗儀器公司；UV-1801紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；液相色譜儀：LabTECH，北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1二氯苯磺酸沉淀亮氨酸

按文獻[15]的方法從鴨毛水解液中沉淀亮氨酸，得到二氯苯磺酸-亮氨酸復合物沉淀。

1.3.2二氯苯磺酸-亮氨酸復合物沉淀重結晶

按1.3.1的方法，由400 g鴨毛的水解液沉淀得到二氯苯磺酸-亮氨酸復合物沉淀粗品，置于燒杯中，加適量水，加熱至80℃，得重結晶溶解液，溶液體積約500 mL。靜置，冷卻至室溫(20℃)結晶，12 h后抽濾，用水洗滌兩次，干燥得二氯苯磺酸-亮氨酸復合物沉淀精品。

1.3.3鋇鹽法脫除沉淀劑

將二氯苯磺酸-亮氨酸復合物沉淀精品50 g置于燒杯中，加水，加熱至80℃溶解，溶解液約200 mL。趁熱加入75 mL 250 g/L氯化鋇溶液，維持溫度60℃，攪拌1 h。再攪拌冷卻至室溫。抽濾，用水洗滌兩次，得濾液320 mL。

1.3.4制取亮氨酸

脫除沉淀劑后濾液旋蒸至約100 mL，冷卻結晶，抽濾，得亮氨酸粗品。再采用常規(guī)的水溶、脫色、濃縮、結晶的方法精制，得亮氨酸精品。

1.3.5二氯苯磺酸沉淀劑再生

將脫除沉淀劑得到的二氯苯磺酸鋇沉淀(干重41 g)置于200 mL燒杯中，加50 mL水攪散，呈泥漿,加熱至80℃，一次性加入3 mol/L硫酸25 mL，繼續(xù)保溫攪拌反應2 h。抽濾，水洗三次。濾液為回收的二氯苯磺酸沉淀劑，濾渣為硫酸鋇。

1.3.6液相色譜法測定氨基酸含量

采用大連依利特公司的氨基酸分析系統(tǒng)，按文獻[16]的方法進行氨基酸分析。

1.3.7二氯苯磺酸鹽溶解度的測定

取適量二氯苯磺酸-亮氨酸復合物、二氯苯磺酸銨、二氯苯磺酸鈉和二氯苯磺酸鋇于100 mL錐形瓶中，加水20 mL，樣品量應足夠，以保證樣品不會完全溶解。在恒溫水浴震蕩器中震蕩10 h，靜置2 h。取清液稀釋，在274 nm處用紫外可見分光光度計測定其吸光度，與標準樣對照計算樣品中二氯苯磺酸的含量，再推算此二氯苯磺酸鹽在水中的溶解度。

2 結果與討論

2.1 工藝路線

采用二氯苯磺酸沉淀法，以毛發(fā)為原料提取氨基酸是先將毛發(fā)酸水解，再從水解液中沉淀亮氨酸，得到二氯苯磺酸-亮氨酸復合物。再對復合物重結晶、脫除沉淀劑及精制工序最終得到亮氨酸產(chǎn)品。為提高亮氨酸產(chǎn)品收率，還需對工藝過程中產(chǎn)生的母液合理套用，最終形成的亮氨酸提取工藝路線見圖1。

圖1 亮氨酸提取工藝路線Fig.1 Process route for extracting leucine

2.2 二氯苯磺酸-亮氨酸復合物沉淀的精制

毛發(fā)水解液含有十七種氨基酸及其它雜質(zhì)，從毛發(fā)水解液中沉淀得到的二氯苯磺酸-亮氨酸復合物含雜量很高(表1)，需進一步提純。

二氯苯磺酸-亮氨酸復合物是一種依靠靜電引力的鹽結晶，在水中的溶解度隨溫度升高而升高。因此可以采用在水中升溫溶解、再降溫結晶的方式進行精制。實驗發(fā)現(xiàn)，在80℃溶液中，結晶完全溶解，冷卻到室溫(20℃)可析出大量結晶。

按1.3.1和1.3.2的方法，從400 g羽毛水解液得到二氯苯磺酸-亮氨酸復合物粗品80.4 g；重結晶后得到二氯苯磺酸-亮氨酸復合物精品50.0 g。各種物料中氨基酸分布情況見表1。

表1 各種物料相對比例及氨基酸含量(單位：g)Tab.1 Relative proportion of various materials and amino acid content (unit: g)

由表1可見，二氯苯磺酸-亮氨酸復合物粗品中含有大量的其它氨基酸，經(jīng)過重結晶精制后得到的復合物精品中其它氨基酸含量大幅降低，其它氨基酸占氨基酸總量的比例由粗品的51.0%降為5.2%；亮氨酸占氨基酸總量的比例由粗品的49.0%提高到94.8%，可見精制效果顯著。

2.3 鋇鹽法脫除沉淀劑

與二氯苯磺酸類似，二甲苯磺酸也能與亮氨酸形成二甲苯磺酸-亮氨酸復合物結晶。為得到亮氨酸產(chǎn)品，常采用氨解的方法將亮氨酸與二甲苯磺酸分離，具體方法是將復合物結晶分散于水中，升溫至80～90℃，加氨水調(diào)pH7～8，再冷卻結晶。由于亮氨酸溶解度較小，此時亮氨酸析出，鄰二甲苯磺酸及銨鹽留在溶液中，可以實現(xiàn)亮氨酸與二甲苯磺酸的分離。

二氯苯磺酸可與陽離子在一定條件下形成結晶，陽離子包括酸性條件下帶正電荷的亮氨酸，也包括銨離子、鈉離子、鋇離子等。表2為各種二氯苯磺酸鹽在20℃條件下的溶解度和溶度積。

表2 二氯苯磺酸鹽在20℃條件下的溶解度和溶度積Tab.2 Solubility and solubility product ofdichlorobenzenesulfonate at 20℃

實驗發(fā)現(xiàn)，如果采用氨解的方法，不能實現(xiàn)二氯苯磺酸與亮氨酸的分離。原因是二氯苯磺酸銨的溶解度也比較小，在氨解條件下部分二氯苯磺酸銨與亮氨酸一同析出，無法有效分離。

由表2 可見，二氯苯磺酸與鋇離子形成的結晶溶解度比二氯苯磺酸-亮氨酸的溶解度更小。如果在二氯苯磺酸-亮氨酸復合物的熱溶解液中加入氯化鋇溶液，可以生成二氯苯磺酸鋇沉淀，從而釋放出亮氨酸。反應式如下：

2Leu-P + BaCl2= 2Leu + BaP2+ 2HCl

式中Leu代表亮氨酸；P代表二氯苯磺酸；Leu-P代表二氯苯磺酸-亮氨酸復合物；BaP2代表二氯苯磺酸鋇。

2.4 亮氨酸產(chǎn)品質(zhì)量

按1.3.4的方法，對脫除二氯苯磺酸后的濾液蒸發(fā)濃縮，冷卻結晶即可得到亮氨酸粗品。此粗品中仍含有一定的雜質(zhì)，顏色為黃色。需進一步采用常規(guī)的水溶、脫色、濃縮、結晶的方法精制，得亮氨酸精品。根據(jù)氨基酸行業(yè)的質(zhì)量標準和檢驗方法，以美國藥典(USP34)標準為參照，對得到的亮氨酸產(chǎn)品質(zhì)量進行檢驗，結果見表3。

表3 亮氨酸的質(zhì)量標準和檢測結果Tab.3 Quality standards and test results of leucine

2.5 產(chǎn)品收率

由圖1可以看出，整個亮氨酸提取工藝過程中產(chǎn)生了多種含有亮氨酸的母液，可以分別套用在上一工序中，以提高產(chǎn)品收率。

按此方式進行五次實驗，去掉首次運行的結果，計算亮氨酸的平均收率為4.1%。

2.6 二氯苯磺酸沉淀劑的回收

轉化為二氯苯磺酸鋇的沉淀劑需要重新轉化為二氯苯磺酸，再次用于沉淀亮氨酸。本文采用加硫酸生成硫酸鋇沉淀，二氯苯磺酸留在溶液中的方法。反應式如下：

BaP2+ H2SO4= BaSO4+ 2P

為了保證二氯苯磺酸完全釋放，需要先將二氯苯磺酸鋇沉淀在水中分散，加熱，再加入稀硫酸生成硫酸鋇沉淀。根據(jù)計算，41 g二氯苯磺酸鋇需要3 mol/L硫酸23 mL才能完全轉化為硫酸鋇，為保證轉化效果，可稍多加硫酸，以保證二氯苯磺酸沉淀劑回收完全。按1.3.5的方法得到硫酸鋇濾渣呈黑色，含有部分有機物雜質(zhì)，可能來自于水解液。硫酸鋇濾渣在105℃烘干后質(zhì)量為16.8 g，在850℃高溫電爐中灼燒2 h后殘渣質(zhì)量為16.3 g。表明硫酸鋇濾渣中的有機質(zhì)較少，可能含有的二氯苯磺酸更少，可以認為97%以上的二氯苯磺酸沉淀劑已被回收到濾液中，可以再次用于沉淀亮氨酸。

3 結論

3.1采用水中重結晶法可大幅度提高二氯苯磺酸-亮氨酸復合物的純度；

3.2鋇鹽脫除二氯苯磺酸沉淀劑法方法簡單，脫除沉淀劑的效果較好，脫除率達92.2%；

3.3可制得合格的亮氨酸產(chǎn)品，產(chǎn)品收率較高，可達4.1%(相對于鴨毛重量)；

3.4沉淀劑容易再生，再生回收率不低于97%。