郝苗苗，余良主，秦方，謝敏，朱海麗

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧437100)

病理性疼痛是一種慢性疾病，其臨床表現(xiàn)為痛覺過敏、自發(fā)性疼痛以及痛覺超敏等[1]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至可導(dǎo)致患者喪失生活自理能力。腫瘤細(xì)胞可激活外周傷害性感受器，并將疼痛信號上行傳導(dǎo)至脊髓和脊髓上中樞，導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞活化、內(nèi)源性阿片系統(tǒng)功能抑制、神經(jīng)元活化、突觸重構(gòu)等，致使中樞敏化，從而產(chǎn)生病理性疼痛[2]。SRT1720屬于喹喔啉甲酰胺鹽酸鹽，分子式為C25H23N7OS，相對分子質(zhì)量為506.02，是一種選擇性人源沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源物1(SIRT1)激活劑，可通過氨基末端催化區(qū)的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合到SIRT1上，從而發(fā)揮作用[3]。2018年6～10月，本研究觀察了SRT1720鞘內(nèi)給藥對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠疼痛的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制，以期為慢性病理性疼痛的機(jī)制研究及小分子鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：雌性SD大鼠18只購于湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量160～200 g，6～8周齡。細(xì)胞：大鼠乳腺癌MRMT-1細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。主要試劑：二甲基亞砜(DMSO)、SRT1720、蛋白酶抑制劑cocktail均購自美國Sigma公司，加強(qiáng)型RIPA lysis buffer、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗兔lgG(H+L，A0208)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素+鏈霉素混合液均購自美國HyClone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，anti-SIRT1(A0127)、anti-rabbit-β-actin(A1978)均購自中國ABclonal公司，anti-rabbit-pSer47-SIRT1(PA5-17391)購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 模型建立及分組處理 將18只雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和SRT1720組，每組6只。模型組和SRT1720組均建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型，方法如下[4]：將大鼠乳腺癌MRMT-1細(xì)胞置于含10% FBS、1% L-谷氨酰胺、2% 青霉素+鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集細(xì)胞并重懸于HBSS緩沖液。模型組和SRT1720組采用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹膜麻醉，剃毛消毒；脛骨上半部分開口，微量注射器將10 μL MRMT-1細(xì)胞懸液(含3×105個細(xì)胞)注射到左側(cè)脛骨髓腔內(nèi)，骨蠟封口。假手術(shù)組注射相同體積HBSS緩沖液。將SRT1720溶解在DMSO中，使用前用生理鹽水按體積比1∶1進(jìn)行稀釋，調(diào)整濃度為20 mmol/L。建模12 d后，SRT1720組剃除注射部位毛發(fā)并進(jìn)行注射部位皮膚表面消毒，用無菌微量注射器于L5和L6脊椎棘突間隙垂直進(jìn)針，當(dāng)出現(xiàn)空洞感時證明注射器已進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，將注射器由垂直緩慢傾斜至45°；根據(jù)體質(zhì)量單次注射SRT1720 1.0 mg/kg，注射完畢后緩慢取出微量注射器，輕輕按壓注射部位1～2 min[5]。模型組與假手術(shù)組注射相同體積DMSO+生理鹽水(體積比為1∶1)。

1.3 疼痛情況觀察 采用50%縮足閾值(PWT)評價。各組給藥后0、1、3、5、7、24 h，根據(jù)up-down法檢測50% PWT。方法如下：將動物放置于行為測試籠內(nèi)，當(dāng)其安靜狀態(tài)時，用Von Frey纖維(0.4～26 g)對大鼠后足底正中部進(jìn)行垂直剌激，刺激時纖維稍微彎曲2～3 s即可，每相鄰的兩次刺激之間間隔2 min。安靜狀態(tài)下動物在受到刺激后出現(xiàn)舔足或者抬足等行為視為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。當(dāng)出現(xiàn)陽性反應(yīng)時，需用相鄰較低一級力度的Von Frey纖維進(jìn)行刺激；當(dāng)出現(xiàn)陰性反應(yīng)時，需用相鄰較高一級力度的Von Frey纖維進(jìn)行刺激。在出現(xiàn)與前一次測試反應(yīng)不一致的測試結(jié)果時開始記錄(連同反應(yīng)出現(xiàn)變化前的一次測試在內(nèi))，記錄6次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測[6]。50% PWT(g)=(10[Xf+Kδ])/10 000，Xf為本次行為學(xué)測試中使用的最后一個Von Frey纖維的階數(shù)，K為痛覺閾矯正系數(shù)(可查表獲得)，δ為相鄰不同纖維刺激之間的差異，即0.224[7]。

1.4 脊髓組織SIRT1、p-SIRT1表達(dá)檢測 采用Western blotting法。各組給藥后24 h，給予戊巴比妥鈉50 mg/kg處死，分離整個脊柱。用眼科剪從中間分離脊柱，暴露脊髓，用解剖剪剝離脊膜，得到完整的脊髓，分離腰段脊髓。加入含有酶抑制劑的RIPA裂解液勻漿組織，4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min；取上清，加入1/3體積的4×上樣緩沖液，沸水浴加熱10 min，BCA蛋白分析試劑盒檢測上清中的蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，TBS-T洗膜5 min×3次。分別加入SIRT1、p-SIRT1一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜。加入二抗，室溫孵育1 h。TBS-T緩沖液洗膜3次，Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，Image J軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算SIRT1、p-SIRT1蛋白相對表達(dá)量，并計(jì)算p-SIRT1/SIRT1。

1.5 脊髓組織TNF-α表達(dá)檢測 采用ELISA法。取各組大鼠腰段脊髓組織，使用含有蛋白酶抑制劑混合物的PBS緩沖液(pH 7.4)進(jìn)行勻漿，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、樣品各100 μL加入孔中，37 ℃條件下反應(yīng)90 min。棄液后按每孔100 μL依次加入抗TNF-α抗體工作液，37 ℃條件下反應(yīng)60 min。洗滌后加入100 μL ABC工作液，37 ℃條件下反應(yīng)30 min。洗滌后加入90 μL TMB顯色液，37 ℃條件下反應(yīng)25～30 min，加入TMB終止液。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的OD值。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點(diǎn)50% PWT比較 與假手術(shù)組比較，模型組給藥后0、1、3、5、7、24 h的50% PWT均降低，SRT1720組給藥后0、24 h的50% PWT均降低(P均<0.05)；與模型組同時間點(diǎn)比較，SRT1720組給藥后1、3、5、7、24 h的50% PWT均升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點(diǎn)50% PWT比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 各組脊髓組織SIRT1、p-SIRT1、TNF-α表達(dá)及p-SIRT1/SIRT1比較 與假手術(shù)組比較，模型組脊髓組織SIRT1、p-SIRT表達(dá)均降低，TNF-α表達(dá)升高(P均<0.05)；與模型組比較，SRT1720組脊髓組織SIRT1、p-SIRT1表達(dá)及p-SIRT1/SIRT1均升高，TNF-α表達(dá)降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組脊髓組織SIRT1、p-SIRT1、TNF-α表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

病理性疼痛會引發(fā)外周敏化和中樞敏化，外周敏化的特征為傷害性感受器激活，導(dǎo)致痛覺閾值降低；中樞敏化表現(xiàn)為脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活、神經(jīng)興奮性和突觸功能增加等[7]?；谌橄侔┑陌l(fā)病率和轉(zhuǎn)移率均較高[8]，本研究將大鼠乳腺癌細(xì)胞MRMT-1注入大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)，利用雌性大鼠構(gòu)建乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型。結(jié)果顯示，模型組、SRT1720組給藥后0 h的50% PWT均明顯低于假手術(shù)組，表明建模成功；模型組給藥后1、3、5、7、24 h的50% PWT均低于假手術(shù)組，表明乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠的機(jī)械痛敏增加；SRT1720組給藥后1、3、5、7、24 h的50% PWT均高于模型組，表明SRT1720鞘內(nèi)給藥可降低乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠的機(jī)械痛敏、減輕其疼痛。

SIRT1是一種NAD+依賴型的去乙酰化酶，其激動劑可明顯改善鼠類痛覺行為，而SIRT1沉默可逆轉(zhuǎn)這種鎮(zhèn)痛效果[9,10]。SIRT1能夠催化組蛋白底物和非組蛋白底物的乙酰賴氨酸，并進(jìn)行去乙?；磻?yīng)，其中乙酰賴氨酸修飾指將乙?；砑拥侥繕?biāo)蛋白內(nèi)部賴氨酸殘基的ε-NH3上；賴氨酸去乙?；笇①嚢彼嵘系囊阴；鶊F(tuán)移除，使蛋白質(zhì)發(fā)生去乙?；揎梉11]。SIRT1通過其去乙?；富钚栽谌旧|(zhì)重塑、基因調(diào)控、代謝、癌癥等相關(guān)疾病發(fā)生及延緩衰老等方面發(fā)揮重要作用[12]。SIRT1-Ser47是SIRT1酶活的活化位點(diǎn)，該位點(diǎn)的磷酸化水平表示SIRT1酶活，其磷酸化水平上調(diào)表明SIRT1活性升高，并可激活SIRT1靶基因表達(dá)[13]。本研究以p-SIRT1/SIRT1表示SIRT1的激活程度，即活化的SIRT1在總SIRT1中所占的比例。結(jié)果顯示，模型組脊髓組織SIRT1、p-SIRT1蛋白相對表達(dá)量均低于假手術(shù)組，表明其SIRT1表達(dá)和活性均下降；SRT1720組脊髓組織SIRT1、p-SIRT1蛋白相對表達(dá)量均高于模型組，表明SRT1720鞘內(nèi)給藥可顯著激活SIRT1活性。

SIRT1可通過多種途徑參與痛覺的調(diào)控。SIRT1可調(diào)控NF-κB p65亞單位轉(zhuǎn)錄后的乙?；揎椝?，上調(diào)NF-κB活性，影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生[14]。在神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠中，脊髓SIRT1可下調(diào)代謝性谷氨酸受體(mGluR1/5)表達(dá)，影響膜受體及離子通道功能，參與突觸可塑性并影響突觸傳遞效能[15]。在嗎啡耐受痛覺模型大鼠中，激活SIRT1可逆轉(zhuǎn)已上調(diào)的NMDA受體(NR1和NR2B)表達(dá)，抑制突觸后信號傳導(dǎo)及炎癥反應(yīng)[16]。在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)中，SIRT1通過細(xì)胞自噬途徑調(diào)節(jié)酸離子通道表達(dá)，抑制H+介導(dǎo)的疼痛信號[3]。在糖尿病引發(fā)神經(jīng)痛模型中，激活SIRT1可降低突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白突觸后致密體蛋白95和生長相關(guān)蛋白43表達(dá)，抑制已增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)突觸可塑性[17]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上與突觸密切相關(guān)，有助于神經(jīng)元回路建立和重組、神經(jīng)元活動調(diào)節(jié)和突觸結(jié)構(gòu)維持[18]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在各種疼痛相關(guān)的損傷狀態(tài)下被激活，并且可持續(xù)很長時間[19]?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞可釋放多種炎癥介質(zhì)如TNF-α，以增強(qiáng)和延長持續(xù)性疼痛[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組脊髓組織TNF-α表達(dá)均高于假手術(shù)組和SRT1720組，而假手術(shù)組和SRT1720組脊髓組織TNF-α表達(dá)無明顯差異；這表明TNF-α參與了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠的疼痛過程，而SRT1720鞘內(nèi)給藥可顯著減輕TNF-α引起的炎性反應(yīng)。但是，TNF-α是否為SIRT1參與痛覺的調(diào)控途徑之一，以及SIRT1與TNF-α的相互作用仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，SRT1720鞘內(nèi)給藥可減輕乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠疼痛，其機(jī)制可能與激活脊髓SIRT1活性及抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。