穆清爽，張繼云，古力鮮·馬合木提，盧雪玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，烏魯木齊830063)

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)是一種發(fā)生于肺間質(zhì)、累及肺泡上皮和肺血管的肺部炎癥性疾病，常見(jiàn)于中老年人，臨床表現(xiàn)為肺限制性通氣或換氣功能障礙，可進(jìn)一步誘發(fā)呼吸衰竭。IPF患者的生存時(shí)間僅為3～5年，臨床5年生存率不足50%[1]。既往研究認(rèn)為，IPF發(fā)病與肺間質(zhì)纖維母細(xì)胞增生、肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積有關(guān)[2,3]，而mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞異常增殖和下游相關(guān)p70S6、4EBP1蛋白異常激活被證實(shí)與上述病理變化有關(guān)[4]。雷帕霉素(RAPA)是一種mTOR信號(hào)通路抑制劑，臨床常用于器官移植后的免疫抑制治療，關(guān)于其抗纖維化作用目前報(bào)道不多。2018年10月～2019年6月，本研究觀察了RAPA對(duì)IPF小鼠的治療作用及其對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 45只BALB/c雄性小鼠，6～8月齡，體質(zhì)量(21.0±2.0)g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。注射用鹽酸博來(lái)霉素溶液(15 mg/支)購(gòu)于日本化藥株式會(huì)社，RAPA(5 mg/支)購(gòu)于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；羥脯氨酸(HYP)ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)MyBioSource公司，蛋白磷酸酶抑制劑(PMSF)、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海天能生物科技有限公司，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄及SYBR Green試劑盒均購(gòu)于日本TaKaRa公司，抗體纖溶酶原激活物抑制物1(PAI-1，ab82218)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1，ab64715)、mTOR(ab2732)、Ⅱ型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3-Ⅱ，ab48394)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt，ab38449)、磷酸化S6核糖體蛋白(p-S6，109393)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF，ab6992)以及HRP標(biāo)記的多聚抗鼠IgG(ab6728)均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 建模與分組處理 45只BALB/c雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為模型組、治療組及對(duì)照組，每組15只。模型組、治療組參照文獻(xiàn)[5]方法建立IPF模型，即采用異氟烷進(jìn)行麻醉，仰臥位固定后縱向切皮分離氣管，向氣管內(nèi)滴注0.2 mL博來(lái)霉素(4 mg/L)；對(duì)照組向氣管內(nèi)滴注等量生理鹽水。各組滴注完成后迅速直立旋轉(zhuǎn)小鼠使藥物分布均勻，縫合皮膚并進(jìn)行消毒。治療組按照體質(zhì)量給予2 mg/kg RAPA腹腔注射，1次/d，連續(xù)15 d；模型組與對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射。各組給藥21 d后處死，立即分離肺臟組織，取部分新鮮組織立即用于制備石蠟切片及HYP含量測(cè)定，其余組織液氮保存。

1.3 肺組織病理觀察 ①HE染色：取各組肺組織石蠟切片，常規(guī)進(jìn)行HE染色，PBS沖洗，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺泡出血程度、肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度、肺泡壁厚度及是否形成透明膜等4個(gè)方面，對(duì)各組肺組織病理改變及炎癥情況進(jìn)行評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高表示小鼠病理變化越嚴(yán)重、炎癥浸潤(rùn)越明顯。②Masson染色：取各組肺組織石蠟切片，梯度水化，先后用Regaud蘇木精和Masson麗春紅酸性染液染色5 min；PBS沖洗后吸干水分，2%冰醋酸浸潤(rùn)洗滌1次，1%磷鉬酸水溶液浸潤(rùn)3 min;苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，行Masson染色。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織纖維化程度，Masson染色可將膠原纖維染成藍(lán)色、肌纖維染成紅色；參照文獻(xiàn)[14]方法，每個(gè)樣本取5個(gè)視野進(jìn)行纖維化評(píng)分，取平均值。

1.4 肺組織HYP含量檢測(cè) 采用ELISA法。各組取10 mg新鮮肺組織，干燥后攪碎并充分混合，根據(jù)堿水解法采用110 ℃、6 mol/L HCl溶液懸浮水解組織樣品，加入等量6 mol/L NaOH溶液高壓堿式消化16 h。參照ELISA檢測(cè)試劑盒加入二甲氨基苯甲醛與吡咯環(huán)反應(yīng)，測(cè)定生成的紅色化合物在558 nm波長(zhǎng)處的光密度值，以此計(jì)算肺組織HYP含量。

1.5 肺組織TGF-β1、PAI-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取各組肺組織石蠟切片，脫蠟后經(jīng)常規(guī)梯度水化及抗原修復(fù)，采用30% H2O2溶液室溫孵育30 min，5% BSA室溫封閉1 h。分別加入TGF-β1和PAI-1一抗(1∶500)，4 ℃孵育8 h或至過(guò)夜；PBS沖洗3次，滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h。PBS沖洗3次，加入DAB顯色液室溫顯色5 min后沖凈染色液，二甲苯透明，中性樹脂封片。于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，TGF-β1、PAI-1陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色深染，記錄同一視野下陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算TGF-β1、PAI-1陽(yáng)性表達(dá)率。

1.6 肺組織膠原蛋白1(Collagen1)、Collagen3及CTGF mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組液氮保存的肺組織，充分研磨成粉末后加入TRIzol試劑，提取總RNA；微量核酸定量?jī)x定量檢測(cè)各樣本RNA濃度及純度合格后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA。參照SYBR Green試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Collagen1、Collagen3、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 肺組織mTOR、LC3-Ⅱ、p-S6、p-Akt蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組液氮凍存的肺組織50 mg，加入5倍體積預(yù)冷的RIPA裂解液及1%的PMSF，組織勻漿,取上清用于BCA蛋白定量。調(diào)節(jié)樣品濃度一致，加入等體積SDS上樣緩沖液，100 ℃變性蛋白樣品5 min；各樣品取30 g蛋白加入12% SDS-PAGE凝膠上樣孔，120 V恒壓電泳90 min；轉(zhuǎn)移蛋白條帶至活化后的PVDF膜，固定轉(zhuǎn)膜夾，0.2 A恒流轉(zhuǎn)膜75 min。采用5% BSA室溫封閉后行常規(guī)抗體孵育，凝膠成像儀曝光成像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理情況比較 ①HE染色結(jié)果：對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)異常病變；模型組肺泡腔消失，組織間隙可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增多；治療組組織病變較模型組減輕，肺泡腔形態(tài)基本恢復(fù)，肺泡內(nèi)炎癥浸潤(rùn)減輕；模型組、治療組和對(duì)照組炎癥評(píng)分分別為(2.51±0.40)、(1.61±0.36)、(1.15±0.27)分，組間兩兩比較P均<0.05。②Masson染色結(jié)果：對(duì)照組無(wú)明顯藍(lán)染，模型組可見(jiàn)清晰的藍(lán)染膠原纖維積聚并伴隨肺泡腔皺縮，治療組氣道周圍少許索條狀藍(lán)染；模型組、治療組和對(duì)照組纖維化評(píng)分分別為(3.08±0.54)、(2.31±0.33)、(1.26±0.31)分，組間兩兩比較P均<0.05。

2.2 各組肺組織HYP含量及TGF-β1、PAI-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 見(jiàn)表1。

2.3 各組肺組織Collagen1、Collagen3、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表2。

表1 各組肺組織HYP含量及TGF-β1、PAI-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與治療組比較，#P<0.05。

表2 各組肺組織Collagen1、Collagen3、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與治療組比較，#P<0.05。

2.4 各組肺組織mTOR、LC3-Ⅱ、p-S6、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表3。

表3 各組肺組織mTOR、LC3-Ⅱ、p-S6、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與治療組比較，#P<0.05。

3 討論

mTOR屬于磷酸肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶家族，是一種廣泛存在于人體和哺乳動(dòng)物中的不典型絲/蘇氨酸蛋白激酶[6]，以mTOR complex 1(mTORC1)和mTOR complex 2(mTORC2)復(fù)合物形式存在，而在與RAPA相關(guān)mTOR信號(hào)通路的研究中發(fā)現(xiàn),只有mTORC1對(duì)RAPA刺激敏感[7,8]。有研究表明，RAPA可分別通過(guò)介導(dǎo)IGF/PI3K/Akt/mTOR、TSC1-Tsc2/Rheb/mTOR或AMPK/TSC/mTOR信號(hào)通路及其下游蛋白磷酸化水平，參與多種疾病發(fā)生過(guò)程中的蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞自噬或線粒體代謝等生物學(xué)過(guò)程[9,10]。但是，關(guān)于RAPA對(duì)IPF的治療作用及其機(jī)制相關(guān)研究較少。

本研究首先通過(guò)組織切片染色觀察各組炎癥及纖維化等病理變化，結(jié)果可見(jiàn)模型組纖維化程度明顯，其炎癥及纖維化評(píng)分較對(duì)照組顯著升高，證實(shí)IPF小鼠模型建造成功；治療組給予RAPA連續(xù)治療15 d后，其肺組織在組織結(jié)構(gòu)完整性、肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及組織膠原堆積等方面均存在改善，說(shuō)明RAPA對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的IPF小鼠具有一定治療作用。Masson染色結(jié)果表明，治療組較模型組肺組織膠原纖維沉積明顯減少，纖維化評(píng)分降低。HYP作為機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，可作為衡量不同組織間膠原蛋白沉積的重要指標(biāo)。肺組織膠原蛋白沉積及纖維結(jié)締組織生成是IPF發(fā)生、發(fā)展的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，治療組肺組織HYP含量及Collagen 1、Collagen 3、CTGF mRNA表達(dá)均明顯低于模型組，提示RAPA能夠通過(guò)減少IPF小鼠肺組織膠原蛋白沉積和結(jié)締組織生成而逆轉(zhuǎn)IPF進(jìn)程。

以往研究顯示，CTGF mRNA轉(zhuǎn)錄受上游TGF-β1調(diào)控，TGF-β1可結(jié)合CTGF啟動(dòng)子區(qū)順式結(jié)合元件,招募Smad結(jié)合元件共同誘導(dǎo)CTGF表達(dá)，同時(shí)TGF-β1可參與以膠原為主的ECM生成[11～13]。因此，TGF-β1與CTGF可共同誘導(dǎo)IPF的發(fā)生。TGF-β1、PAI-1表達(dá)與肺纖維化程度呈正相關(guān)，并且二者協(xié)同參與調(diào)控纖維蛋白溶解系統(tǒng)及體內(nèi)成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[12]。PAI-1參與膠原重塑依賴性纖溶酶/基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP-10)/MMP-1軸,或體內(nèi)microRNA表達(dá)調(diào)控相關(guān)Collagen1/3的合成[13]。本研究結(jié)果顯示，模型組、治療組和對(duì)照組TGF-β1、PAI-1陽(yáng)性表達(dá)率均依次降低；說(shuō)明RAPA可能通過(guò)抑制TGF-β1、PAI-1表達(dá),調(diào)控下游Collagen1、Collagen3、CTGF表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)纖溶酶原激活、抑制成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)及體內(nèi)ECM沉積的作用。

在原代肺成纖維細(xì)胞纖維化模型中，TGF-β1可促進(jìn)mTORC1活化和Collagen3、纖維黏連蛋白(FN)表達(dá)[14]，而mTOR的異常表達(dá)可間接反映肺纖維化進(jìn)程，因此本研究通過(guò)檢測(cè)mTOR及相關(guān)蛋白表達(dá)變化以驗(yàn)證RAPA對(duì)IPF小鼠的治療作用。結(jié)果表明，模型組肺組織mTOR與p-S6蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加，而治療組二者表達(dá)水平較模型組顯著降低，但仍與對(duì)照組存在顯著差異。有研究報(bào)道，RAPA能夠通過(guò)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)而激活組織及細(xì)胞自噬活性，在這類級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，各類細(xì)胞因子可通過(guò)激活PI3K而促進(jìn)下游Akt的磷酸化，進(jìn)而使得mTOR受到Tsc1/Tsc2的激活而活化[15]。LC3-Ⅱ介導(dǎo)的自噬活性下降可促進(jìn)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和FN表達(dá)，進(jìn)而加劇ECM沉積，促進(jìn)IPF進(jìn)程[16]。本研究結(jié)果顯示，治療組肺組織p-Akt、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平較模型組顯著升高，提示RAPA可逆轉(zhuǎn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織自噬缺陷。綜合上述mTOR表達(dá)結(jié)果，表明RAPA可靶向抑制mTOR信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白因子的表達(dá)調(diào)控作用，減輕IPF小鼠的炎癥及纖維化程度。

綜上所述，RAPA可減輕IPF小鼠的炎癥及纖維化程度，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1及mTOR表達(dá)進(jìn)而調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。