韓樂，趙征，宋養(yǎng)榮，雷寶霞，陳文娟

(陜西省腫瘤醫(yī)院，西安710061)

肺癌是臨床上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，非小細胞肺癌是其主要類型，約占85%[2]。盡管隨著放化療和靶向治療的不斷完善以及免疫檢測點抑制劑的應(yīng)用，肺癌患者的預(yù)后得到很大改善，但原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥均嚴重影響患者預(yù)后，Ⅳ期患者5年生存率僅為10%[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1(FOXC1)是FOX蛋白家族成員之一，在多種腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮致癌基因作用[4]，并與肝癌、乳腺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5,6]。2018年3～12月，本研究上調(diào)人非小細胞肺癌H1299細胞中FOXC1的表達，觀察其對細胞生物學行為的影響，并對其機制進行初步探索?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人肺腺癌H1299細胞取自株陜西省腫瘤醫(yī)院實驗室。主要試劑：RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；FOXC1抗體和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)試劑盒購自美國Abcam公司，鼠抗人β-actin抗體購自美國Sigma公司，二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司和美國GeneTex公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；FOXC1目的基因質(zhì)粒、空載體質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

1.2 細胞分組處理 將液氮中保存的H1299細胞進行常規(guī)復(fù)蘇，加入含RPMI1640 +10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的H1299細胞，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為4×105/mL，每孔2 mL細胞懸液接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)。待細胞融合達40%～80%且細胞狀態(tài)良好時，更換為無血清培養(yǎng)基，隨機分為觀察組和對照組。觀察組按照Attractene Transfection Reagent說明書在EP管中配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物，包含97.6 μL TE buffer、2.4 μL FOXC1目的基因質(zhì)粒、4.5 μL Attractene Reagent，混勻后室溫放置15 min，加入6孔板中。對照組采用同樣的方法轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒。兩組轉(zhuǎn)染48 h擴大培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗。

1.3 FOXC1表達檢測 ①FOXC1 mRNA表達：采用實時熒光定量PCR法。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h的細胞，加入裂解液提取總RNA，測定濃度和純度合格后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行熒光定量PCR檢測。FOXC1上游引物5′-CGCCACAACCTCTCGCTCAAC-3′，下游引物5′-TGTCCTTCTCCTTGTCCTTCA-3′，引物長度21 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′，引物長度20 bp；采用2-ΔΔCT法計算FOXC1 mRNA相對表達量。②FOXC1蛋白表達：采用Western blotting法。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h的細胞，加入蛋白裂解液，冰上充分裂解約30 min，提取總蛋白，進行蛋白定量并制備蛋白樣品。SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%BSA搖床室溫封閉1 h；1×TBST洗滌3次，每次15 min。加入DKK1(1∶2 000)和內(nèi)參β-actin(1∶8 000)一抗，4 ℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，每次15 min；加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，1×TBST洗滌3次，每次15 min；ECL顯影、曝光。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計算FOXC1蛋白相對表達量。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用MTT法。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h的細胞，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1.5×104/mL，每孔200 μL細胞懸液接種于96孔板，設(shè)置5個復(fù)孔，共8塊孔板。每天固定時間拿出1塊孔板，加入20 μL MTT試劑(5 mg/mL)培養(yǎng)4 h，棄掉孔中液體；加入DMSO 150 μL，酶標儀上測定492 nm波長處的光密度(OD)值，連續(xù)檢測8 d。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細胞克隆形成能力觀察 采用平板克隆實驗。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h的細胞，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為2×103/mL，每孔100 μL細胞懸液接種于6孔板，補充細胞懸液至2 mL?；靹蚝蟪Ｒ?guī)培養(yǎng)，當肉眼可見克隆形成時終止培養(yǎng)，PBS洗滌3次；甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染液染色20 min，自來水沖洗，空氣干燥。計數(shù)可見克隆數(shù)，計算克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell細胞侵襲實驗。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h的細胞，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×104/mL。Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室基底膜，室溫風干。取200 μL細胞懸液加入含8 μm孔徑膜的Transwell上室，下室中加入500 μL完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。拿出小室，PBS沖洗，干凈棉簽擦去微孔膜內(nèi)層細胞；甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min，沖洗染液，室溫風干。隨機選取10個視野，計數(shù)穿過基底膜的細胞數(shù)，取平均值。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 細胞MMP-2蛋白表達檢測 收集兩組轉(zhuǎn)染48 h的細胞，參照1.3采用Western blotting法檢測MMP-2蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞FOXC1 mRNA及蛋白表達比較 觀察組細胞FOXC1 mRNA及蛋白相對表達量分別為0.950±0.020、1.540±0.020，對照組分別為0.010±0.001、0.620±0.030,兩組比較P均<0.05。

圖1 兩組細胞FOXC1蛋白表達情況(Western blotting法)

2.2 兩組細胞增殖能力比較 兩組培養(yǎng)1～4 d細胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，觀察組培養(yǎng)5～8 d細胞增殖能力均高于對照組(P均<0.05)。見圖2。

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

圖2 兩組培養(yǎng)1～8 d細胞增殖曲線(MTT法)

2.3 兩組細胞克隆形成能力比較 觀察組細胞克隆形成率為0.24%±0.01%，對照組為0.13%±0.01%，兩組比較P<0.05。見圖3。

圖3 兩組細胞克隆形成情況

2.4 兩組細胞侵襲能力比較 觀察組穿過基底膜的細胞數(shù)為(320.67±3.06)個，對照組為(129.33±6.03)個，兩組比較P<0.05。

2.5 兩組細胞MMP-2蛋白表達比較 觀察組細胞MMP-2蛋白相對表達量為2.42±0.03,對照組為1.25±0.59，兩組比較P<0.05。見圖4。

圖4 兩組細胞MMP-2蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

近年來，人們越來越重視轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，轉(zhuǎn)錄因子可以改變多種癌基因或抑癌基因表達，有望成為臨床干預(yù)腫瘤的治療靶點[7]。FOX蛋白家族是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，其主要特征是具有翼狀螺旋的DNA結(jié)合域，在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學過程中均發(fā)揮重要作用[8,9]。FOXC1是FOX家族成員之一，定位于人染色體6p25上，其編碼的FOXC1蛋白由553個氨基酸構(gòu)成[10]。FOXC1最初被發(fā)現(xiàn)在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有關(guān)鍵作用，其基因突變已被普遍認為是Axenfeld-Rieger綜合征發(fā)病的主要原因[11,12]。

FOXC1已被證實在肝癌、乳腺癌、白血病等多種惡性腫瘤細胞中呈高表達，并與細胞遷移及侵襲相關(guān)。在乳腺癌細胞中，上調(diào)FOXC1表達可以促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而下調(diào)FOXC1表達則產(chǎn)生相反作用，其機制可能與FOXC1誘導MMP-7表達有關(guān)[13,14]。在肝癌細胞中，過表達FOXC1可以引起初級肝癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導致肝癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強，而下調(diào)FOXC1表達則可減弱上述過程，且過表達FOXC1可以上調(diào)鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snai1表達，但會下調(diào)鈣黏附蛋白E表達[15]。研究表明，胃癌組織中FOXC1表達明顯高于癌旁組織，且FOXC1表達與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤深度有關(guān),FOXC1高表達提示患者預(yù)后不良[16]。FOXC1可顯著增加食管鱗癌細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲能力[17]。研究顯示，F(xiàn)OXC1低表達的非小細胞肺癌患者生存時間長于FOXC1高表達者[18]。本研究結(jié)果顯示，觀察組細胞FOXC1 mRNA及蛋白相對表達量均明顯高于對照組，說明觀察組成功轉(zhuǎn)染FOXC1目的基因質(zhì)粒并過表達FOXC1；本研究觀察組培養(yǎng)5～8 d細胞增殖能力、克隆形成率、穿過基底膜的細胞數(shù)均明顯高于對照組，說明過表達FOXC1可促進H1299細胞的增殖及侵襲能力。

MMP-2屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族中成員中的明膠酶亞群，編碼基因位于人染色體16q21。MMP-2是一種明膠酶，可通過降解基底膜的重要組成成分Ⅳ型膠原而促進腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。在肺癌組織中，MMP-2表達與肺癌轉(zhuǎn)移傾向具有正相關(guān)性，下調(diào)MMP-2表達可以顯著抑制肺癌轉(zhuǎn)移[20]。在肝細胞癌細胞中下調(diào)FOXC1表達，可以同時導致MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9表達下調(diào)，且會減弱肝細胞癌細胞的遷移及侵襲能力[21]。本研究結(jié)果顯示，觀察組MMP-2蛋白相對表達量明顯高于對照組，提示過表達的FOXC1可能通過上調(diào)MMP-2表達而影響H1299細胞的生物學行為。

綜上所述，過表達的FOXC1可能通過上調(diào)MMP-2表達而促進H1299細胞增殖及侵襲，為后續(xù)深入研究FOXC1在非小細胞肺癌中的作用機制奠定基礎(chǔ)。