崔菀真，朱彧，岳偉

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津301617；2天津市環(huán)湖醫(yī)院 天津市腦血管與神經(jīng)變性重點實驗室)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，也是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的50%～60%。近年來，分子靶向成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床研究的熱點[1]。烷基甘油酮磷酸合酶(AGPS)是醚酯合成的關(guān)鍵酶，對癌細(xì)胞的生成具有重要作用[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸的RNA序列，因缺少完整的開放閱讀框而無法編碼蛋白質(zhì)，但lncRNA可通過多種生物學(xué)過程調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面均具有重要作用[3]。mRNA指信使RNA，即攜帶遺傳信息的RNA，最終能編碼出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。2019年1～6月，本研究通過基因芯片技術(shù)獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的基因全序列，采用生物信息學(xué)方法分析AGPS對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞lncRNA、mRNA表達(dá)譜的影響并預(yù)測其功能，為研究AGPS促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司。兩種沉默率不同的慢病毒shR-AGPS-1、shR-AGPS-2均購自美國Sigma公司，陰性對照慢病毒、羊抗鼠IgG抗體、β-Tublin抗體、羊抗兔IgG抗體均購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司，總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，lncRNA+mRNA二合一芯片、末端標(biāo)記和雜交試劑盒均購自美國Gene Chip公司，全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，抗AGPS抗體購自美國Santa公司，Western LightningTM化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Perkin Elmer公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染 將U251細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃條件下CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d按2×105/孔接種于6孔板，每孔加2 mL培養(yǎng)基，至細(xì)胞融合率達(dá)60%～80%。將shR-AGPS-1、shR-AGPS-2和陰性對照慢病毒分別置于含聚凝胺的DMEM培養(yǎng)基中，將U251細(xì)胞分為shR-AGPS-1組、shR-AGPS-2組和對照組，分別加入上述培養(yǎng)基。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染24 h，更換為不含聚凝胺的DMEM完全培養(yǎng)液2 mL，置于孵箱內(nèi)37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3 單克隆細(xì)胞篩選及細(xì)胞形態(tài)觀察 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后加嘌呤霉素進(jìn)行篩選，初始嘌呤霉素濃度設(shè)置為1 μg/mL，每3 d更換1次篩選液繼續(xù)進(jìn)行篩選。將細(xì)胞進(jìn)行稀釋，制備密度為1×103/mL的單細(xì)胞懸液，以0.2 mL/孔接種于96孔板的第1排；從第1排吸取0.1 mL細(xì)胞懸液接種于第2排，一直到第8排，篩選獲得單克隆細(xì)胞。將單克隆細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得單克隆細(xì)胞系。倒置顯微鏡下觀察三組細(xì)胞形態(tài)及增殖情況。

1.4 AGPS蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。將三組篩選后的細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后加入蛋白裂解液RIPA 300 μL/孔，4 ℃條件下?lián)u動30 min，將細(xì)胞裂解液移至1.5 mL離心管。配置10% SDS-PAGE分離膠，取50 μg蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，至目的蛋白有效分離，濕法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上形成印跡。用Blotto溶液室溫?fù)u動封閉2 h，將膜按蛋白的印跡位置剪開，分別加入抗AGPS抗體(1∶1 000)和兔抗原β-Tublin一抗(1∶1 000)，4 ℃條件下?lián)u動過夜。 TBST溶液搖動漂洗5 min，共4次。加入二抗，抗AGPS抗體(1∶1 000)使用HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，內(nèi)參β-Tublin(1∶1 000)使用HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體。室溫條件下孵育1.5 h，TBST溶液搖動漂洗5 min，共4次。將膜置于Western LightningTM化學(xué)發(fā)光劑中，30 s后進(jìn)行顯影、定影處理，采用Image J軟件分析各組條帶灰度值。AGPS蛋白相對表達(dá)量以AGPS條帶灰度值與內(nèi)參β-Tublin條帶灰度值的比值表示。

1.5 lncRNA及其共表達(dá)mRNA表達(dá)譜建立及差異表達(dá)篩選 取三組篩選后的細(xì)胞，通過總RNA提取試劑盒提取總RNA，全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建和擴(kuò)增，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測lncRNA及其共表達(dá)mRNA表達(dá)譜。使用R軟件包將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以對照組作為標(biāo)準(zhǔn)，對shR-AGPS-1組、shR-AGPS-2組差異表達(dá)的lncRNA及其共表達(dá)mRNA進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|FC|>1.2、P<0.05、誤判率<0.05，F(xiàn)C>0表示表達(dá)上調(diào)、FC<0表示表達(dá)下調(diào)。

1.6 lncRNA共表達(dá)mRNA的功能預(yù)測 應(yīng)用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對lncRNA共表達(dá)的mRNA進(jìn)行基因本體(GO)富集分析，對差異基因進(jìn)行功能注釋。通過京都基因與基因組大百科全書(KEGG)對lncRNA共表達(dá)的mRNA進(jìn)行富集分析，得到差異基因參與的信號通路，并對信號通路進(jìn)行一級及二級分類。

1.7 lncRNA共表達(dá)mRNA信號通路作用網(wǎng)絡(luò)、全局信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)、lncRNA對通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape軟件，根據(jù)KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間相互作用關(guān)系,構(gòu)建lncRNA共表達(dá)mRNA信號通路作用網(wǎng)絡(luò)；分析信號通路作用網(wǎng)絡(luò)對應(yīng)的mRNA，根據(jù)基因、蛋白質(zhì)、化合物之間的作用關(guān)系,構(gòu)建全局信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)；根據(jù)lncRNA和靶基因的顯著性通路，利用lncRNA和靶基因通路的屬性，構(gòu)建lncRNA對通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)節(jié)點周圍連線計算節(jié)點的特征值和節(jié)點度。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞形態(tài)及增殖情況比較 與對照組比較，shR-AGPS-1組和shR-AGPS-2組細(xì)胞均出現(xiàn)團(tuán)縮以及增殖抑制等變化，且shR-AGPS-2組變化更加顯著。見圖1。

2.2 三組細(xì)胞AGPS蛋白表達(dá)比較 shR-AGPS-1組、shR-AGPS-2組和對照組細(xì)胞AGPS蛋白相對表達(dá)量分別為0.44±0.09、0.19±0.09、1.00±0.13，兩組間比較P均<0.05。見圖2。

圖1 三組細(xì)胞形態(tài)及增殖情況觀察

注：A為對照組,B為shR-AGPS-1組,C為shR-AGPS-2組。

圖2三組細(xì)胞AGPS蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

2.3 lncRNA差異表達(dá)篩選結(jié)果 與對照組比較，shR-AGPS-1組73個lncRNA表達(dá)上調(diào)、107個lncRNA表達(dá)下調(diào)，shR-AGPS-2組266個lncRNA表達(dá)上調(diào)、233個lncRNA表達(dá)下調(diào)。

shR-AGPS-1組篩選出差異倍數(shù)最大的前20個lncRNA分別為LINC00837、CTC-436K13.3、AK129941、MIR548AA2、linc-FCGR1B-7、CR626472、ERI3-IT1、linc-AKR1B10-2、AF344193、AK098597、LINC01079、XXbac-B33L19.4、ENST-00000551732、AF086041、linc-LOC388630-3、linc_luo_384、AC-008440.10、linc_luo_541、linc-SEC23B、linc-CNTN3-3，F(xiàn)C分別為1.79、-1.76、-1.64、-1.58、-1.57、1.49、1.48、1.44、1.44、-1.42、1.41、1.41、1.40、-1.40、-1.40、-1.40、1.40、1.39、-1.39、-1.39。

shR-AGPS-2組篩選出差異倍數(shù)最大的前20個lncRNA分別為LINC00837、CR618823、MIR548AA2、LINC00973、FENDRR、linc_luo_1251、LINC00263、linc-JAK1-1、BC013423、linc-COL1A2-2、linc_luo_1846、linc-WDR7-7、AC003092.1、uc001tkz.2、linc_luo_1223、AL110176、LUCAT1、CTC-436K13.3、linc-U2AF1-1、uc003flo.2，F(xiàn)C分別為2.95、-2.59、-2.58、-2.42、2.21、-2.11、-2.01、-1.95、-1.88、-1.87、-1.85、-1.83、-1.82、-1.81、-1.79、-1.78、-1.76、-1.76、1.71、-1.70。

2.4 lncRNA共表達(dá)mRNA差異表達(dá)篩選結(jié)果 與對照組比較，shR-AGPS-1組13個mRNA表達(dá)上調(diào)、63個mRNA表達(dá)下調(diào)，shR-AGPS-2組61個mRNA表達(dá)上調(diào)、111個mRNA表達(dá)下調(diào)。

shR-AGPS-1組篩選出差異倍數(shù)最大的前20個mRNA分別為CXCL8、OR2J2、SLC7A11、THBS1、APOH、KIR2DL5B、HMGA2、LTB、PSAT1、BLID、ZNF404、SLC38A1、CXCL8、PRPS1、IGHD3-16、ZNF404、HIST1H3I、C3orf17、CHML、IGFBP1，F(xiàn)C分別為-2.1、1.84、-1.81、1.58、-1.56、1.53、-1.53、1.5、-1.49、-1.45、-1.44、-1.43、-1.43、1.42、-1.42、-1.42、1.41、-1.41、-1.41、-1.39。

shR-AGPS-2組篩選出差異倍數(shù)最大的前20個mRNA分別為CXCL8、AGPS、IGFBP1、APOH、CXCL8、SLC7A11、SLC38A1、THBS1、PTGS2、TREM1、SCD、CHML、OGFRL1、IL7R、IGFBP3、SEL1L3、HMGA2、PSAT1、DOCK10、ROS1，F(xiàn)C分別為-6.94、-4.53、-4.22、-3.22、-2.7、-2.67、-2.45、2.31、-2.29、-2.28、-2.21、-2.2、-2.16、-2.15、-2.12、-2.09、-2.06、-2.05、-2.03、-2.03。

2.5 lncRNA 共表達(dá)mRNA的功能預(yù)測結(jié)果 GO富集分析結(jié)果顯示，lncRNA共表達(dá)mRNA注釋的顯著性功能主要包括細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)介導(dǎo)的蛋白反應(yīng)、細(xì)胞黏附、血管生成正向調(diào)節(jié)等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，lncRNA共表達(dá)mRNA顯著富集的信號通路包括晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體 (RAGE)信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、TNF信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)合成、瘧疾等。見圖3。一級分類結(jié)果顯示，差異基因顯著富集的信號通路主要涉及人類疾病、環(huán)境信息傳遞以及生物體系統(tǒng)等過程；二級分類結(jié)果顯示，差異基因顯著富集的信號通路主要涉及感染性疾病的發(fā)生、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、腫瘤發(fā)生等過程。

圖3 lncRNA共表達(dá)mRNA的GO和KEGG富集分析結(jié)果

2.6 lncRNA共表達(dá)mRNA信號通路作用網(wǎng)絡(luò)和全局信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 lncRNA共表達(dá)mRNA信號通路作用網(wǎng)絡(luò)包括37個節(jié)點和158條連線，連線較多的節(jié)點為磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)信號通路、Toll樣受體信號通路、補(bǔ)體系統(tǒng)、黏著斑以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路等。全局信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)包括75個節(jié)點和164條連線，連線較多的節(jié)點為表皮生長因子受體(EGFR)、整合素α11蛋白(ITGA11)、胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)等。

2.7 lncRNA對通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 該網(wǎng)絡(luò)包括136個節(jié)點，其中包含94個lncRNA以及42個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，節(jié)點之間共有979條連線。特征值最高的lncRNA為AK093732，該lncRNA處于網(wǎng)絡(luò)的樞紐地位，對多個信號通路和樣本狀態(tài)有重要的調(diào)控價值。特征值分析結(jié)果顯示，差異lncRNA所調(diào)控的核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即細(xì)胞因子與受體相互作用。篩選出特征值最高的前20個lncRNA分別為AK093732、LINC01384、FENDRR、uc011bsz.1、linc-PTPRN2、linc-U2AF1-1、RP11-221N13.3、BC042023、BC043357、linc_luo_1251、linc_luo_35、linc_luo_1223、LINC00973、linc-ANKRD20A1-20、linc-NBPF15-1、uc003flo.2、linc-ANKRD20A1-14、linc-DUSP10-7、linc-FOXB2-3、linc-WISP3-2，節(jié)點度分別是34、27、25、25、24、24、24、23、23、23、23、22、22、22、22、22、21、21、21、21。特征值最高的前20個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分別為細(xì)胞因子及其受體相互作用、PI3K/AKT信號通路、細(xì)胞黏附分子、AGE/RAGE信號通路、p53信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、NF-κB信號通路、單純皰疹感染、瘧疾、TNF信號通路、胰高血糖素信號通路、黏著斑、HTLVI型感染、甲型流感、膀胱癌、南美錐蟲病、癌癥的中心碳代謝、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、黑熱病，節(jié)點度分別是49、45、40、36、36、36、34、33、33、30、29、28、28、27、26、26、25、24、22、22。

3 討論

AGPS是一種對醚類脂質(zhì)形成至關(guān)重要的酶，AGPS可將?；视?3-磷酸轉(zhuǎn)化為烷基甘油-3-磷酸，是生成所有醚類脂質(zhì)的必要步驟[4]。癌細(xì)胞以不同于正常細(xì)胞的方式代謝脂質(zhì)[5,6]，腫瘤組織中醚類脂質(zhì)含量高于正常組織[7]，并且在高侵襲性腫瘤中醚類脂質(zhì)表達(dá)水平增高。因此，改變AGPS表達(dá)水平能夠使侵襲性較弱的癌細(xì)胞也產(chǎn)生侵襲性和致瘤性[2]。本研究對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞進(jìn)行AGPS沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，shR-AGPS-1組、shR-AGPS-2組均出現(xiàn)了不同程度的團(tuán)縮及增殖抑制，且shR-AGPS-2組團(tuán)縮及增殖抑制更明顯、AGPS表達(dá)更低，說明AGPS對于維持腫瘤細(xì)胞形態(tài)和致病特性具有重要作用。

lncRNA以往被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物、基因轉(zhuǎn)錄組的噪音，但是現(xiàn)有研究證實lncRNA在RNA水平上對細(xì)胞生長、分化以及多能干細(xì)胞維護(hù)、癌癥發(fā)生過程均具有重要的調(diào)節(jié)作用[8,9]。本研究篩選了與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的lncRNA,并利用生物信息學(xué)方法分析lncRNA參與調(diào)控的生物學(xué)功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，構(gòu)建lncRNA對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得到處于樞紐地位的lncRNA。LINC01384是本研究得到的樞紐之一，是腫瘤抑制因子FOXA2鄰近的lncRNA。Liang及其同事將該lncRNA命名為LNCNEF，該研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)LNCNEF是從上游FOXA2基因轉(zhuǎn)錄而來，可以順式調(diào)控FOXA2表達(dá)，LNCNEF通過抑制Wnt/β-catenin軸而激活FOXA2表達(dá)，從而抑制體內(nèi)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[10]。FENDRR是一種對血管發(fā)育具有重要作用的內(nèi)皮細(xì)胞基因，F(xiàn)ENDRR過表達(dá)可促進(jìn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11～15]。研究證實，F(xiàn)ENDRR對人類肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤具有重要的調(diào)控作用，其可通過抑制HuR/MDR1軸降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性，通過抑制SOX4蛋白表達(dá)而延緩結(jié)腸癌進(jìn)展[16～19]。目前，F(xiàn)ENDRR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤方面的研究尚無文獻(xiàn)報道。本研究中AGPS沉默后細(xì)胞FENDRR表達(dá)較對照組顯著提高，說明FENDRR表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，但是FENDRR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用及相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。一項關(guān)于反式白藜蘆醇的研究發(fā)現(xiàn)，在服用神經(jīng)保護(hù)制劑反式白藜蘆醇的小鼠大腦中，其linc-PTPRN2表達(dá)較服用標(biāo)準(zhǔn)飲食的小鼠顯著下調(diào)，推測反式白藜蘆醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用可能與其降低不同基因表達(dá)有關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐地位之一的linc-PTPRN2通過調(diào)控共表達(dá)的細(xì)胞間黏附分子-1，間接參與調(diào)控細(xì)胞黏附分子、AGE/RAGE、NF-κB、TNF等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但是,關(guān)于linc-PTPRN2在這些信號通路中的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究信號通路作用網(wǎng)絡(luò)和全局信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中連線較多的節(jié)點為PI3K信號通路、Toll樣受體信號通路、VEGF信號通路等，在lncRNA對通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中AK093732處于網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的樞紐地位，細(xì)胞因子與受體相互作用為lncRNA調(diào)控的核心通路。

綜上所述，沉默AGPS表達(dá)可通過引起神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相關(guān)lncRNA及其共表達(dá)mRNA的差異表達(dá)而影響細(xì)胞增殖和凋亡，其中PI3K、Toll樣受體及VEGF信號通路可能是其主要靶點通路。本研究篩選了與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的lncRNA和mRNA，這些差異表達(dá)的lncRNA及其共表達(dá)mRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，為進(jìn)一步研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。同時本研究建立了lncRNA對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)更進(jìn)一步研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤中關(guān)鍵lncRNA在信號通路中的調(diào)控作用機(jī)制提供了方向。