劉 芬，劉曉媛，高 翔，葛曉松

1.江南大學附屬醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇 無錫，214062；

2.江南大學附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇 無錫，214062；

3.江南大學附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 無錫，214062

中國最新癌癥流行病學的數(shù)據(jù)顯示［1］，食管癌發(fā)病率男性居第三位，女性居第五位；食管癌死亡率居癌癥致死率第四位。盡管近年來ESCC治療取得了極大進展，但ESCC患者預(yù)后仍然不理想，5年總生存率低于10%［2］。究其原因，主要是ESCC發(fā)現(xiàn)晚，手術(shù)治療后仍然易發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。而目前，我們對ESCC侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制仍不完全清楚。因此，闡明ESCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，對改善治療策略和預(yù)測臨床預(yù)后具有重要的科學意義和應(yīng)用價值。

近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）成為腫瘤研究的熱點之一。lncRNA一般不具備蛋白編碼功能，長度大于200 bp，lncRNA通過在表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層次調(diào)控目的基因的表達，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［4-6］。文獻報道，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒1-反義鏈1（Zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1，ZEB1-AS1）在人ESCC中高表達，且與腫瘤分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后相關(guān)［7］。但是，lncRNA ZEB1-AS1在食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機制鮮見報道。本研究從細胞與分子層面探討了lncRNA ZEB1-AS1促進食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制。

1 方 法

1.1 試劑

DMEM培養(yǎng)基、100×青霉素-鏈霉素混合液（雙抗）購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Clark公司，LipofectamineTM2000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自東仁化學科技（上海）有限公司。ZEB1單克隆抗體購自美國Proteintech公司。GAPDH抗體、蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。Lnc ZEB1-AS1的小干擾RNA（siZEB1-AS1）及其陰性對照（siRNA negative control，siNC）由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。特異性引物（ZEB1-AS1、ZEB1、β-actin）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 細胞及培養(yǎng)

人ESCC細胞KYSE-30/180/410/510、EC109這5株細胞株均由本實驗室保存，Eca109、TE-1、TE-13、CaEs-17購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，靜置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的增濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染方法

收取對數(shù)生長期的Eca-109細胞，每孔5×105個細胞均勻加到6孔板中，或者5×103個細胞均勻加到96孔板中。細胞完全貼壁后，按照LipofectamineTM2000說明書，分別轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siZEB1-AS1）及其陰性對照（siNC），終濃度100 nmol/L，37 ℃溫育6 h，棄轉(zhuǎn)染液，加入正常完全DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)備用。siZEB1-AS1［8］序列反義鏈為5’-AACUUCUAGCCUCUCUUUCAA-3’，順義鏈為5’-GAAAGAGAGGCUAGAAGUUCC-3’；siNC序列反義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3’，順義鏈為5’-ACGUGACACGUU CGGAGAATT-3’。

1.4 CCK-8實驗

收取對數(shù)生長期的Eca-109細胞，以5×103個細胞均勻加到96孔板中，進行siRNA的轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染后1、2、3、4和5 d，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)溫育3 h。在酶標儀（Biotech）波長450 nm處檢測各孔的吸光度（D）值，以空白孔調(diào)零。每組設(shè)立5個復孔，取平均值，以各組D450nm值代表細胞活力情況。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

嚴格按照試劑說明書，采用TRIzol提取細胞總RNA，Nanodrop 2000測定RNA濃度，檢測其含量及D260nm/D280nm比值。按照試劑盒說明書，取1 μg總RNA、以20 μL體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTFQ-PCR的反應(yīng)條件為95 ℃，30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s共40個循環(huán)。引物序列ZEB1-AS1上游為5’-CACACGGTGCTTGTCTCACT-3’（反義鏈），ZEB1-AS1下游為5’-TAGGATCCCA CGGTTCTACG-3’（順義鏈）；ZEB1上游為5’-TTCAAACCCATAGTGGTTGCT-3’（反義鏈），ZEB1下游為5’-TGGGAGATACCAAACCAA CTG-3’（順義鏈）；β-a c t in上游為5’-G G G CACGAAGGCTCATCATT-3’（反義鏈），下游為5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’（順義鏈）。以β-actin的Ct值作為參照，以2-ΔΔCt計算mRNA倍數(shù)變化。

1.6 蛋白提取及蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

將Eca-109細胞進行siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，進行細胞質(zhì)蛋白的提取，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)將蛋白由膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃溫育過夜，隨后用PBST緩沖液漂洗，加入二抗（1∶1 000）室溫溫育2 h，PBST漂洗，ECL顯影。

1.7 劃痕實驗

對Eca-109細胞進行siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，收集細胞，接種于6孔板內(nèi)，使細胞貼壁后融合度達90%以上。用10 μL移液器吸嘴劃線，PBS漂洗后，在顯微鏡下拍照記錄各組細胞劃痕寬度。更換0.5%血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。分別于1、2和3 d后拍照，記錄各組細胞劃痕寬度，計算細胞的劃痕閉合率。

1.8 Transwell實驗

細胞遷移實驗：將Eca-109細胞進行siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，更換無血清DMEM培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h。次日收集細胞，PBS漂洗3次，重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基中。將200 μL、5×104個細胞加入小室中，小室放入24孔板內(nèi)，小室外加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48 h后，取出小室，預(yù)冷無水甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色1 h，清水漂洗。顯微鏡下觀察拍照。

細胞侵襲實驗：細胞處理同細胞遷移實驗。小室內(nèi)提前加入一層Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃凝固待用。收集饑餓處理后的細胞，PBS漂洗3次，重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基中。將200 μL、5×104個細胞加入小室中。后續(xù)步驟同細胞遷移實驗。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有實驗均需重復3次，數(shù)據(jù)采用表示。采用統(tǒng)計學軟件包SPSS 17.0進行分析，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 9株ESCC細胞中l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1的表達水平

采用RTFQ-PCR檢測9株ESCC細胞中l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1的表達水平。結(jié)果顯示，lncRNA ZEB1-AS1在Eca-109細胞中表達水平最高（圖1），選取該細胞株為研究對象，進行后續(xù)實驗。

圖1 RTFQ-PCR 方法檢測9株ESCC細胞中l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1的表達水平Fig.1 Expression levels of lncRNA ZEB1-AS1 in 9 ESCC cells were detected by RTFQ-PCR

2.2 lncRNA ZEB1-AS1不影響Eca-109細胞增殖

采用siRNA干擾Eca-109細胞中l(wèi)nc ZEB1-AS1的表達，通過RTFQ-PCR方法檢測細胞中l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組細胞相比，干擾組中l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1的水平顯著下降（57%，圖2A）。我們進一步通過CCK-8實驗檢測lncRNA ZEB1-AS1表達水平的變化是否引起細胞增殖情況改變。CCK-8結(jié)果顯示，抑制lncRNA ZEB1-AS1的表達并未明顯影響Eca-109細胞增殖（圖2B）。

2.3 lncRNA ZEB1-AS1促進Eca-109細胞遷移

我們進一步通過劃痕實驗和Transwell實驗檢測lncRNA ZEB1-AS1表達水平的變化是否引起細胞遷移、侵襲能力的改變。劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組細胞（siNC、Eca-109空白組）相比，干擾組細胞（siZEB1-AS1）2 d和3 d細胞的劃痕閉合率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。同時，Transwell遷移實驗也顯示，遷移至小室膜外側(cè)的干擾組細胞顯著減少［Eca-109空白組為（180±40）個細胞/視野，siNC組為（160±33）個細胞/視野，siZEB1-AS1組為（90±23）個細胞/視野；P＜0.05，圖4A］。這說明lncRNA ZEB1-AS1能促進Eca-109細胞遷移。

圖2 lncRNA ZEB1-AS1不影響Eca-109細胞增殖Fig.2 lncRNA ZEB1-AS1 did not affect cell proliferation

圖3 lncRNA ZEB1-AS1促進Eca-109細胞遷移Fig.3 LncRNA ZEB1-AS1 promoted migration of Eca-109 cells

2.4 lncRNA ZEB1-AS1促進Eca-109細胞侵襲

細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組細胞（siNC）相比，干擾組（siZEB1-AS1）遷移至小室膜外側(cè)的細胞顯著減少［Eca-109空白組為（55±13）個細胞/視野，siNC組為（50±10）個細胞/視野，siZEB1-AS1組為（25±16）個細胞/視野；P＜0.05，圖4B］。這說明lncRNA ZEB1-AS1促進Eca-109細胞侵襲。

圖4 lncRNA ZEB1-AS1促進Eca-109細胞遷移和侵襲Fig.4 lncRNA ZEB1-AS1 promoted migration and invasion of Eca-109 cells

2.5 lncRNA ZEB1-AS1上調(diào)ZEB1的表達

為了研究lncRNA ZEB1-AS1是否調(diào)控ZEB1的表達，通過siRNA干擾Eca-109細胞中l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1的表達后，通過RTFQ-PCR方法和Western blot方法檢測了各組細胞中ZEB1的表達水平。與對照組細胞相比，干擾組（siZEB1-AS1）細胞中ZEB1的mRNA［（72±12）%，P＜0.05］和蛋白［（53±5）%，P＜0.05］水平均顯著降低（圖5）。

圖5 ZEB1 mRNA和蛋白表達水平Fig.5 mRNA and protein expression levels of ZEB1

3 討 論

人lncRNA ZEB1-AS1的基因位于10號染色體短臂，全長2 449 bp［8］。近年來，研究聚焦在lncRNA ZEB1-AS1的癌基因特性。匯總21項涉及1 801例癌癥患者的原創(chuàng)性研究進行Meta分析［9］，發(fā)現(xiàn)癌癥患者lncRNA ZEB1-AS1高表達與患者總生存期（overall survival，OS）、無進展生存期（progression-free survival，RFS）、高腫瘤分期（high tumor stage，HTS）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（lymph node metastasis，LNM）密切相關(guān)，說明lncRNA ZEB1-AS1有望成為預(yù)測腫瘤患者預(yù)后的生物標志物。Wang等［7］的研究結(jié)論與之一致，在ESCC中，lncRNA ZEB1-AS1的表達是ESCC預(yù)后的獨立預(yù)測因子。然而，該項目僅從患者癌組織及癌旁組織中檢測lncRNA ZEB1-AS1的表達水平，并與患者臨床病理學特征及預(yù)后進行分析，并未對其分子機制進行深一步研究。在本研究中，我們進一步從細胞與分子生物學層次，對lncRNA ZEB1-AS1在ESCC中的作用進行探討。我們首次發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZEB1-AS1通過促進ZEB1的表達，促進ESCC細胞遷移、侵襲；然而，并未觀察到lncRNA ZEB1-AS1對細胞增殖有明顯的改變。

以往研究對lncRNA ZEB1-AS1發(fā)揮癌基因作用的分子機制有一定程度的了解。ZEB1 是一個上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的明星轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤惡性行為中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤細胞抗凋亡、耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移甚至干細胞特性；已有研究證明，lncRNA ZEB1-AS1通過上調(diào)ZEB1表達促進肝細胞肝癌［8］、骨肉瘤［10］、前列腺癌［11］、宮頸［12］等轉(zhuǎn)移。lncRNA ZEB1-AS1通過抑制細胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和CDK2抑制細胞周期進程，同時上調(diào)MMP2、MMP9、N-catenin等促進細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移［13］。lncRNA ZEB1-AS1通過抑制細胞周期抑制因子p15，促進結(jié)直腸癌細胞增殖［14］。另一方面，mRNA在腫瘤中發(fā)揮重要作用。lncRNA ZEB1-AS1可作為miR-200s［15］、miR-101［16］的分子海綿，減輕其對ZEB1的抑制作用，促進骨肉瘤和結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移；還可以調(diào)節(jié)miR-577［17］、miR-1224-5p［18］、miR-200b［19］的表達，促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、膀胱癌惡性表型。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZEB1-AS1上調(diào)ESCC細胞中ZEB1 mRNA和蛋白的表達，促進ESCC細胞侵襲、轉(zhuǎn)移。但是，lncRNA ZEB1-AS1改變了ZEB1下游哪些分子的表達，是否引起了ZEB1外其他信號轉(zhuǎn)導通路關(guān)鍵分子的改變，還有待更深入的探討。

總之，我們在細胞與分子生物學水平闡明了lncRNA ZEB1-AS1可能通過促進ZEB1的表達促進ESCC侵襲及轉(zhuǎn)移的機制，從而為食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移機制研究提供新的理論依據(jù)。