劉士博 劉顯

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 四川大學華西口腔醫(yī)院口腔頜面外科，成都 610041

腫瘤、創(chuàng)傷導致的骨生成不足及骨愈合不良，常造成患者生活質量降低，治療時間延長，給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)[1-2]。目前臨床修復骨缺損的金標準是自體骨移植，自體骨具有良好的生物相容性和臨床安全性，但同時面臨移植骨量有限、增加手術創(chuàng)傷等問題[3]。如何有效修復骨缺損，避免上述并發(fā)癥成為臨床亟待解決的問題。

骨損傷最初階段為炎癥反應，炎性細胞及炎性因子促進干細胞募集、增殖并進一步分化為終末細胞（骨細胞等）及非骨形成細胞（纖維細胞等），進而促進骨組織形成[4-5]。上述成骨過程涉及骨微環(huán)境中的多種細胞，如樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、干細胞、成骨細胞（osteocblast，OB）、內皮細胞等，這些細胞相互影響、相互調節(jié)，進而促使骨修復重建，然而細胞間信息如何相互交流的具體機制仍未得到明確解釋[6]。傳統(tǒng)理論認為，細胞可分泌細胞因子，通過旁分泌途徑進行細胞間信號交流，而多數細胞因子體內半衰期較短（如轉化生長因子-β1激活后體內半衰期僅2 min），作用半徑很小，無法有效進行遠端傳遞，而遠端骨損傷時存在干細胞募集趨化行為[7]，推測骨缺損修復過可能存在某種細胞間通訊方式，促進骨微環(huán)境中的細胞信號傳遞從而促進骨組織形成。外泌體（exosome）作為旁分泌途徑的重要媒介，是細胞間交流和遺傳物質轉運的重要介質，在骨損傷修復過程中發(fā)揮著重要作用，在組織工程中受到越來越多的關注。本文綜述了不同細胞來源外泌體在骨缺損修復中的重要作用，以期為外泌體應用于骨組織工程促進骨修復提供幫助。

1 外泌體生物學特征

外泌體是細胞外囊泡的一種亞型，可由多種細胞分泌，如DC、干細胞、上皮細胞、腫瘤細胞等，廣泛分布于血清、尿液、唾液及其他體液中。分離提取外泌體主要有超速離心法、超濾法、試劑盒提取等方法[8]。

外泌體起初被認為是細胞代謝排泄的廢棄物，隨著研究[9]發(fā)現，其對細胞間信號傳遞也有著至關重要的作用。外泌體內容物多種多樣，并根據其源細胞不同而存在差異。外泌體可在細胞之間傳遞抗原呈遞分子、RNA、蛋白質完成細胞間通訊，進而調節(jié)靶細胞的功能及活性[10]。研究[11]表明，受體-配體的相互作用在這一過程中起到了重要作用，外泌體可以通過跨膜蛋白直接與靶細胞信號受體相互作用，或與受體質膜融合將內容物遞送到胞質中，也可內化至受體細胞中從而發(fā)揮相應生理作用。

2 不同細胞源性外泌體與骨修復

2.1 DC源性外泌體與骨修復

大量臨床和實驗研究[12]揭示了炎癥反應與骨缺損修復的緊密聯系：骨缺損修復需要炎癥反應的有效控制，過度的炎癥反應可加速骨組織的破壞與吸收。免疫細胞參與抗原識別、特異性免疫應答，對炎癥調節(jié)有重要作用，而DC作為免疫細胞的重要組成，其如何參與炎癥調節(jié)，促進骨缺損修復也逐漸受到關注。研究[13]表明，DC源性外泌體可抑制T細胞增殖從而延遲膠原誘導的小鼠關節(jié)炎的發(fā)作。DC可通過分泌外泌體攜載抑炎因子miR-155及抗炎因子miR-146a作用于T細胞等免疫細胞，從而調節(jié)炎癥反應[14]。DC源性外泌體除參與調節(jié)炎癥反應外，還可作用于間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），促進骨修復再生所需活性因子的分泌，從而使骨向分化順利進行。Transwell實驗顯示DC源性外泌體可促進骨髓MSCs的遷移和募集，內容物檢測其含有骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metal loproteinase-9，MMP-9）、白細胞介素（interleukin，IL）-5等多種募集因子[15]。DC源性外泌體與MSCs共培養(yǎng)后，堿性磷酸酶（alka line phosphatase，ALP）及Runt相關轉錄因子2（Runtrelated transcription factor 2，Runx2）等成骨相關蛋白表達顯著增加，MSCs表現出成骨向分化[16]。

2.2 干細胞源性外泌體與骨修復

干細胞除自身定向成骨分化，還可通過旁分泌途徑促進骨再生，而外泌體作為重要的旁分泌介質，對骨缺損修復有著至關重要的作用。

Liu等[17]發(fā)現，系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型中，移植的MSCs源性外泌體可傳遞Las至受損骨髓MSCs而提升其功能，從而改善骨質疏松表型。研究[18]表明，經成骨誘導后的骨髓MSCs分泌的外泌體與未經誘導的骨髓MSCs共培養(yǎng)后，后者骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、鋅指結構轉錄因子（osterix）、OPN等成骨相關蛋白表達顯著上調，表現出骨向分化。骨髓MSCs源性外泌體可減少骨髓MSCs凋亡及DNA損傷，促進骨髓MSCs增殖，降低骨髓MSCs的放射性損傷[19]。另外，CD9-/-小鼠產生的外泌體數量較野生型小鼠少，骨折愈合速度顯著降低，而注射MSCs源性外泌體后，骨折愈合能力得到顯著提升[20]。經成骨誘導后的MSCs源性外泌體可以促進血管及新骨形成從而修復骨質疏松大鼠顱骨缺損[21]。

骨髓MSCs源性外泌體對OB的成骨分化同樣發(fā)揮重要作用。PKH67標記的骨髓MSCs源性外泌體與OB共培養(yǎng)后，細胞中高爾基體、內質網及溶酶體等細胞器內廣泛檢測到已標記的外泌體，并且ALP、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、OPN及Runx2等成骨相關蛋白表達顯著上調，表明骨髓MSCs分泌的外泌體可以通過內化方式被OB內吞并促進其成骨分化[22]。炎癥狀態(tài)下，脂肪干細胞源性外泌體可促進OB的增殖和骨向分化[23]。

干細胞源性外泌體很大程度上是通過其攜帶的mi-RNA發(fā)揮成骨作用。Qin等[22]發(fā)現，miRNA抑制劑可顯著減弱骨髓MSCs源性外泌體介導的OB向分化，表明miRNA對外泌體促進骨形成有重要作用，研究還發(fā)現骨髓MSCs源性外泌體攜載的miR-196a、miR-27a及miR-206三種miRNA在誘導干細胞成骨分化中發(fā)揮主要作用。另外，MSCs源性外泌體攜載的miR-191、miR-222、miR-21可促進細胞增殖，miR-10b可促進細胞遷移，miR-129、miR-136可調節(jié)血管形成[24-26]。

干細胞源性外泌體在促進成骨作用的同時，還可以協(xié)助調節(jié)炎癥反應。MSCs可通過外泌體傳遞microRNAs以促進巨噬細胞對線粒體的循環(huán)利用而加強其抗炎活性[27]。骨髓MSCs源性外泌體可作為免疫調節(jié)介質，調節(jié)T細胞的成熟、凋亡與增殖[28]。

2.3 OB源性外泌體與骨修復

OB作為骨微環(huán)境的重要組成，可通過分泌外泌體參與調節(jié)成骨-破骨平衡。礦化的OB源性外泌體可促進骨髓基質細胞成骨相關miRNA的分泌，如miR-1192、miR-680及miR-302a，下調其軸抑制因子（axis inhibition，Axin）1的表達并促進β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達，促進其成骨向分化，進而促進骨組織再生[29]。另外，OB前體細胞可分泌含礦化調節(jié)因子轉化生長因子β受體Ⅱ相互作用蛋白1（transforming growth factor beta receptor Ⅱ interacting protein 1，TRIP-1）的外泌體，促進細胞外基質礦化及骨組織形成[30]。

另有研究表明，OB可以通過分泌含核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF κB ligand，RANKL）的外泌體作為媒介促進破骨細胞（osteoclast，OC）形成。甲狀旁腺激素可誘導成骨細胞分泌大量攜載RANKL的外泌體，此外泌體與RAW264.7細胞共培養(yǎng)后可促進OC形成，另外，NFATc1可通過去磷酸化并轉移至細胞核從而促進OC的形成和活化，是RANKL誘導OC形成的主要調節(jié)因子，而上述OC形成過程中檢測到NFATc1發(fā)生核易位；熒光標記顯示外泌體與RAW264.7細胞表面結合，從而進一步誘導上述過程[7]。

2.4 OC源性外泌體與骨修復

骨代謝主要依靠OB的成骨分化與OC的破骨功能相互作用，達到修復骨缺損的目的，因此，在加強成骨作用的同時，如何調節(jié)OC功能也十分重要。研究表明，OC源性外泌體表面核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）被消耗后，其對OC分化的抑制作用得到明顯緩解，表明OC源性外泌體可通過RANK-RANKL信號途徑調節(jié)破骨細胞分化[31]。另外，研究[32]發(fā)現，OC源性外泌體表面蛋白ephrinA2可以靶向結合OB表面受體EphA2而抑制OB活性。miRNA-214與骨改建密不可分，在骨折的老年女性以及骨質疏松大鼠血清中，miRNA-214含量較正常情況下顯著增高。Li等[33]研究表明，OC可分泌外泌體攜帶miRNA-214作用于OB，抑制其成骨及礦化活性，miRNA-214活性抑制后，其抑制成骨的作用隨之緩解。

2.5 內皮細胞源性外泌體與骨修復

骨組織再生與血管形成同樣有著密不可分的聯系。內皮細胞可以促進血管再生，對血管完整性的建立和維持至關重要。內皮細胞源性外泌體含有miRNA-214，一種調控血管生成和內皮細胞功能的活性因子，在作用于相鄰內皮細胞后，可抑制內皮細胞凋亡并促進其遷移，最終促進血管形成[34]。研究[35]表明，老年或骨質疏松患者內皮細胞來源外泌體包含有miRNA-31，骨髓MSCs經miRNA-31作用后成骨分化被抑制。上述研究提示，內皮細胞對成血管與成骨作用呈相反的生理效應，該兩種生理功能是否相互制約或如何達到平衡狀態(tài)從而使骨缺損得到有效修復仍有待研究。

綜上所述，骨缺損修復包括炎性調節(jié)、血管形成及骨組織再生改建等生理過程，骨環(huán)境中的DC、干細胞、OB、OC與內皮細胞可通過分泌外泌體從上述不同過程參與調節(jié)骨修復，外泌體因為其獨特的生物學性質，可能成為骨缺損疾病治療的有效途徑[36-37]。應用外泌體修復骨缺損的方法相對于傳統(tǒng)骨移植有諸多優(yōu)勢，如可通過膜融合的方式被受體細胞內化并利用；含有多種具有成骨作用的活性因子；可近程或遠程傳遞并作用于靶細胞，其囊泡結構可以避免其包含的小分子物質在傳遞過程中被降解；可避免免疫排斥；可與多種生物材料聯合用于修復骨缺損[38]。

然而，外泌體的應用仍具有一定的局限性。目前，外泌體對骨缺損修復的體內體外研究大多只針對局部因素或某單一類型細胞對骨再生的作用，而其系統(tǒng)性的解釋和機制并未得到有效證明；不同細胞源性外泌體對骨缺損修復可表現出相同或相反的效應，而這些外泌體如何相互促進或相互抑制目前并沒有得到明確解釋；外泌體攜載成分及其如何作用靶細胞的具體機制也尚未得到確切闡明。

不同細胞源性外泌體可通過調節(jié)炎癥反應、促進成骨分化、抑制破骨功能、促進血管再生從而促進骨組織形成，為骨缺損的治療提供新思路和新方法。外泌體包含多種生物活性因子，對其進一步的性質與功能分析可為開發(fā)骨缺損修復的治療性外泌體提供可能。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。