楊陽 查定軍

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（西安710032）

藥物耳毒性已成為臨床上普遍關(guān)注的問題，氨基糖苷類藥物[1,2]如慶大霉素等和順鉑、卡鉑是常見的耳毒性藥物。耳毒性是指藥物對(duì)聽覺或前庭功能引起的損傷作用，導(dǎo)致聽力的喪失和平衡的紊亂。人類聽覺和平衡障礙通常歸因于內(nèi)耳中感覺毛細(xì)胞的死亡，由特定凋亡蛋白的活化介導(dǎo)。響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激的熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)的誘導(dǎo)是生物體普遍存在且高度保守的反應(yīng)，該過程能夠通過抑制凋亡蛋白顯著抑制某些系統(tǒng)中的細(xì)胞凋亡，因此其在耳毒性損傷中的保護(hù)作用得到了廣泛關(guān)注。本文就熱休克蛋白家族中幾個(gè)關(guān)鍵性熱休克蛋白在內(nèi)耳耳毒性損傷過程中的機(jī)制等相關(guān)研究進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 熱休克蛋白簡(jiǎn)介

1.1 熱休克蛋白的發(fā)現(xiàn)

熱休克蛋白是一類存在于生物體內(nèi)高度保守、受到高溫、低溫、缺血、氧化等刺激后迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，能夠阻止蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊、穩(wěn)定胞內(nèi)蛋白構(gòu)象并介導(dǎo)蛋白質(zhì)到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞器。HSPs的發(fā)現(xiàn)是從黑腹果蠅唾液腺多絲染色體上的“膨突”現(xiàn)象開始的，研究表明這種現(xiàn)象是由于外界溫度升高導(dǎo)致該區(qū)帶基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)產(chǎn)生一種新的蛋白質(zhì)所致，這種蛋白質(zhì)被命名為熱休克蛋白[3]。編碼熱休克蛋白的基因在細(xì)菌、酵母、果蠅中有大于50%的相似度。

1.2 熱休克蛋白的分類與分布

HSPs的分類有很多種，目前，認(rèn)同較多的是根據(jù)相對(duì)分子量大小及等電點(diǎn)將其大致分為:HSP110、90、70、60和 sHSP 五大家族。也有學(xué)者按照調(diào)控方式將其分為三大類:構(gòu)成型HSPs(Constitutive or cognate heat shock proteins，HSCs)、誘導(dǎo)型 HSPs(Inducible heat shock proteins，HSPs)和HSPs類似物(HSPs cognate，HSCs)。構(gòu)成型 HSPs是一類在正常狀態(tài)下固定表達(dá)的HSPs，參與細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)、正常代謝和生理作用；誘導(dǎo)型HSPs是組織細(xì)胞受到外界刺激時(shí)表達(dá)，以提高組織細(xì)胞耐受性的一類HSPs；HSCs是當(dāng)機(jī)體細(xì)胞處于正常代謝和生理調(diào)控過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。

正常生理?xiàng)l件下HSPs廣泛存在于腎、肝、肺等包括內(nèi)耳在內(nèi)的器官中，在真核生物的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體內(nèi)呈現(xiàn)基礎(chǔ)表達(dá)。HSPs通常占細(xì)胞總蛋白量的5%，在高溫等應(yīng)激反應(yīng)條件下，在巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)被顯著誘導(dǎo)，表達(dá)水平最高可能升至細(xì)胞總蛋白量的15%。

1.3 熱休克蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

HSPs主要由高度保守的能夠與ATP結(jié)合的氨基端和多變性的能夠結(jié)合未折疊多肽的羧基端兩部分構(gòu)成。HSPs基因的表達(dá)通過熱休克因子(heat shock factors，HSFs)和熱休克元件(heat shock elements，HSEs)來實(shí)現(xiàn)，其轉(zhuǎn)錄可分為:1、HSF的激活；2、HSF與HSE的結(jié)合；3、HSPs的基因轉(zhuǎn)錄。正常情況下單體形式存在的HSF不具有與HSE結(jié)合的能力，只有當(dāng)HSF形成三聚體時(shí)才能結(jié)合HSE，從而促進(jìn)HSPs基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)生命體受到不同應(yīng)激原刺激時(shí)，機(jī)體組織內(nèi)不斷增多的受損傷蛋白會(huì)以競(jìng)爭(zhēng)的形式與HSPs的氨基端結(jié)合，來恢復(fù)其自身的功能結(jié)構(gòu)。而在這時(shí)，被游離出來的HSF繼續(xù)形成三聚體進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合HSE并促進(jìn)HSPs基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)HSPs達(dá)到一定量時(shí)會(huì)和HSF結(jié)合從而抑制HSPs基因的表達(dá)。

HSPs由于磷酸化、甲基化等產(chǎn)生的多種異構(gòu)體會(huì)影響其功能與代謝的穩(wěn)定性，并影響其與不同的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，通過形成和解離參與有關(guān)蛋白的折疊、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和降解等，來調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能，但并不參與靶蛋白的組成，因此也被稱為“分子伴侶”[4]。其次，HSPs能夠維持細(xì)胞內(nèi)的生物活性，包括細(xì)胞內(nèi)看守自衛(wèi)、抗理化因素及反應(yīng)性過氧化物等的損傷[5]。第三，HSPs能夠參與抗原提呈加工、協(xié)同免疫及自身免疫[6]。此外，還有影響胚胎的發(fā)育、作為凋亡途徑的抑制劑[7]等功能。

2 熱休克蛋白在內(nèi)耳耳毒性中的研究

Neely等[8]發(fā)現(xiàn)HSP72在正常豚鼠耳蝸中表達(dá)，隨后人們對(duì)HSPs在內(nèi)耳中進(jìn)行了越來越深入的研究，目前已從基本的蛋白表達(dá)過渡到了DNA分子水平，而如何從基因、轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)層面揭示HSPs的不同生物效應(yīng)已經(jīng)成為HSPs的關(guān)鍵研究方向。

內(nèi)耳耳毒性損傷與能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死的活性氧（ROS）的產(chǎn)生有關(guān)，HSPs感知耳毒性藥物損害和啟動(dòng)響應(yīng)的機(jī)制還未在研究中得到確切結(jié)論。研究表明各種應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生HSPs的共同信號(hào)可能是蛋白質(zhì)的損傷，ROS能夠誘導(dǎo)HSF1的活化和HSPs的產(chǎn)生在很多系統(tǒng)中也都得到了證實(shí)[9]。然而，ROS是否是直接作用于HSF1水平以改變其活性尚不清楚。

2.1 HSP70對(duì)耳毒性損傷的保護(hù)作用

HSP70是最重要的熱休克蛋白之一，在正常細(xì)胞內(nèi)和應(yīng)激狀態(tài)下都有表達(dá)，響應(yīng)熱休克上調(diào)表達(dá)最多，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)合成過程中的組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)以及變性蛋白質(zhì)的降解。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)順鉑的濃度對(duì)大鼠外毛細(xì)胞中HSP70的表達(dá)強(qiáng)度有影響：較低劑量（5-10 mg/kg）順鉑在注射3h內(nèi)HSP70水平相對(duì)快速升高，至12h表達(dá)量穩(wěn)定不變；但較高劑量（20 mg/kg）順鉑在注射后表達(dá)量變化不明顯，且6h后抑制HSP70表達(dá)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)順鉑、卡那霉素和慶大霉素均能夠誘導(dǎo)HSP70在豚鼠耳蝸中表達(dá)，表達(dá)部位在Corti器、血管紋、螺旋韌帶、內(nèi)螺旋緣、螺旋神經(jīng)節(jié)[11]。隨著研究的深入，暴露于新霉素和順鉑中的橢圓囊體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，HSP70在毛細(xì)胞耳毒性藥物損傷中起保護(hù)作用[12]。利用Hsp70.1和Hsp70.3基因敲除小鼠和Hsp70過表達(dá)的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：無論是在前庭橢圓囊還是耳蝸組織中，HSP70過表達(dá)都能夠抑制氨基糖苷類誘導(dǎo)的毛細(xì)胞死亡，并在體內(nèi)減緩聽力喪失[13]。同樣，HSP70可以參與保護(hù)毛細(xì)胞免受順鉑毒性的觀點(diǎn)也被Roy等證實(shí)，聲預(yù)處理后的小鼠能夠增加耳蝸毛細(xì)胞中HSP70的表達(dá)，并且增強(qiáng)毛細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗能力[14]。小鼠橢圓囊體外培養(yǎng)也證實(shí)，熱休克對(duì)HSP70基因敲除小鼠的橢圓囊順鉑誘導(dǎo)的毛細(xì)胞死亡沒有顯著的保護(hù)作用，同時(shí)利用組成型表達(dá)rHSP70i（rHSP70i CE）的轉(zhuǎn)基因小鼠證明HSP70的組成型表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的毛細(xì)胞死亡起到部分保護(hù)作用，而熱休克誘導(dǎo)HSP70過表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的毛細(xì)胞死亡起到更大的保護(hù)作用[15]。

HSP70在毛細(xì)胞耳毒性藥物損傷過程中發(fā)揮的具體效應(yīng)機(jī)制仍然尚無定論。一種可能的機(jī)制是非感覺細(xì)胞分泌HSP70，以旁分泌方式作用于毛細(xì)胞。May等[16]研究表明，在小鼠前庭橢圓囊支持細(xì)胞中利用腺病毒介導(dǎo)HSP70過表達(dá)可以抑制耳毒性損傷引起的毛細(xì)胞死亡。此外，將沒有經(jīng)過熱休克的橢圓囊與熱休克后的橢圓囊體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，沒有經(jīng)過熱休克的橢圓囊也能夠抑制毛細(xì)胞的死亡，然而與HSP70基因敲除小鼠熱休克后的橢圓囊共培養(yǎng)的沒有熱休克的橢圓囊沒有了對(duì)毛細(xì)胞耳毒性損傷的保護(hù)作用，表明支持細(xì)胞介導(dǎo)HSP70保護(hù)毛細(xì)胞免受耳毒性的損傷。HSP70可能通過阻止受損蛋白質(zhì)的積累和聚集，以及通過促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的適當(dāng)再折疊來保護(hù)細(xì)胞免受損傷誘導(dǎo)的死亡，這在其他系統(tǒng)中也已經(jīng)得到證實(shí)[17]。HSP70在內(nèi)耳中的保護(hù)機(jī)制的受體和下游介質(zhì)目前都沒有得到研究的證實(shí)，HSP70的作用模式是否是通過非感覺細(xì)胞直接或間接的影響毛細(xì)胞是值得我們深入挖掘的問題。

2.2 HSP32對(duì)耳毒性損傷的保護(hù)作用

HSP32，也稱為血紅素加氧酶1（HO-1），是血紅素加氧酶蛋白家族的應(yīng)激誘導(dǎo)成員，在底物的誘導(dǎo)及各種氧化應(yīng)激條件下會(huì)增加表達(dá)量，廣泛存在于心、腦、肺、腎等組織和紅細(xì)胞中，是血紅素分解代謝過程中的限速酶，分解血紅素、產(chǎn)生膽綠素、游離鐵和一氧化碳，在應(yīng)激相關(guān)條件下調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。

Watanabe等[18]的研究表明HSP32定位于耳蝸，并在熱休克后誘導(dǎo)表達(dá)。Fairfield等[19]證明HSP32在正常成年大鼠耳蝸的外毛細(xì)胞中組成型表達(dá)，但表達(dá)量低，熱激后，其表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)，定位在Corti器內(nèi)的部分外毛細(xì)胞以及血管紋的邊緣和中間細(xì)胞中。Kim等[20]證明HSP32能夠保護(hù)由順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡，并且抑制劑ZnPPIX對(duì)HSP32活性的抑制和HSP32 siRNA的轉(zhuǎn)染顯著的消除了HSP32在順鉑處理的細(xì)胞中的保護(hù)作用，可能的機(jī)制是HSP32分解代謝產(chǎn)物CO和膽紅素。膽紅素是一種能夠清除過氧自由基并抑制脂質(zhì)過氧化的抗氧化劑[21]，它能夠下調(diào)ROS從而抑制HEIOC1細(xì)胞的凋亡。體外培養(yǎng)前庭橢圓囊的研究顯示，HSP32在橢圓囊巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并對(duì)順鉑誘導(dǎo)的橢圓囊毛細(xì)胞死亡有顯著的保護(hù)作用，同時(shí)過表達(dá)HSP70和HSP32，對(duì)順鉑誘導(dǎo)的毛細(xì)胞死亡并沒有累加或協(xié)同作用[15]。這項(xiàng)研究同樣表明非感覺細(xì)胞是毛細(xì)胞存活和死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[22]。除了對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)之外，HSP32還可能參與順鉑損傷螺旋神經(jīng)元后的修復(fù)過程[23]。

然而，HSP32的效應(yīng)機(jī)制尚不清楚，猜測(cè)其保護(hù)作用可能依賴于巨噬細(xì)胞的分泌體系。肝缺血-再灌注損傷（IRI）系統(tǒng)中已經(jīng)證明HO-1是常駐巨噬細(xì)胞分化所必需的，在體內(nèi)具有保護(hù)作用[24]。其他研究表明，凋亡細(xì)胞衍生的S1P誘導(dǎo)原代巨噬細(xì)胞中有HO-1的表達(dá)，HO-1參與M2型巨噬細(xì)胞的極化，增加抗細(xì)胞凋亡蛋白如Bcl-2或Bcl-XL和Adora A2A的表達(dá)[25]。轉(zhuǎn)染HO-1基因的巨噬細(xì)胞可明顯降低促炎因子TNF-α、IL-6表達(dá)并升高抗炎因子IL-10的表達(dá),顯著減輕大鼠急性心肌梗死(AMI)區(qū)炎癥和氧化損傷[26]。

前人的研究表明通過藥理學(xué)調(diào)節(jié)特異性激活HSP32基因表達(dá)或可成為干預(yù)治療耳毒性的新靶標(biāo)。然而，HSP32在體內(nèi)對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制究竟是通過分解代謝產(chǎn)物CO和膽紅素來作用，還是依賴于巨噬細(xì)胞的分泌體系或是其它途徑，依靠現(xiàn)有的研究還無法解釋清楚。

2.3 其他熱休克蛋白對(duì)耳毒性損傷的保護(hù)作用

HSP27、HSP60等熱休克蛋白在正常大鼠內(nèi)耳中均有表達(dá)，且在不同部位組織表達(dá)不均一。田克勇等[27]研究發(fā)現(xiàn)HSP60在正常大鼠耳蝸Corti器上的支持細(xì)胞中呈構(gòu)成型表達(dá)，硫酸卡那霉素?fù)p傷后表達(dá)量降低，推測(cè)其可能參與了藥物性耳聾的發(fā)病過程。梅玲等[28]研究發(fā)現(xiàn)HSP27主要表達(dá)于耳蝸基底膜Corti器中外毛細(xì)胞的表皮板、外毛細(xì)胞的側(cè)壁、內(nèi)外柱細(xì)胞表面和外柱細(xì)胞的頭、體以及足板，在內(nèi)毛細(xì)胞和支持細(xì)胞上沒有表達(dá)。在發(fā)育成熟的正常Wistar大鼠耳蝸中，HSP27主要的作用是穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)的正常、維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定、維持耳蝸內(nèi)活性氧水平的正常以及執(zhí)行分子伴侶的功能，從而維持耳蝸正常的生理功能。據(jù)報(bào)道，一種在日本臨床開發(fā)和使用的非環(huán)狀聚異戊二烯GGA能夠通過增加HSP27、HSP40和HSP70的表達(dá)抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)物的升高來減弱順鉑誘導(dǎo)的耳毒性并能夠抑制耳蝸中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)噪聲創(chuàng)傷具有保護(hù)作用[29]?？赡艿臋C(jī)制是GGA激活HSF1，該轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)HSPs mRNA的合成，但HSP27、HSP40保護(hù)毛細(xì)胞耳毒性損傷的機(jī)制尚不完全清楚。

3 小結(jié)與展望

本文圍繞熱休克蛋白HSP70、HSP32、HSP27等在耳毒性損傷中的保護(hù)作用和機(jī)制做了總結(jié)與假設(shè)。不可否認(rèn)，熱休克蛋白在細(xì)胞耳毒性損傷過程中的保護(hù)效果有限，其保護(hù)機(jī)制決定其對(duì)于較低劑量的耳毒性藥物造成的細(xì)胞損傷早期具有更好的保護(hù)作用。但隨著研究方法和技術(shù)的不斷改善，我們對(duì)熱休克蛋白保護(hù)機(jī)制將會(huì)在探索中得到更加全面的了解，同時(shí)為有針對(duì)性的開發(fā)抗耳毒性藥物損傷的保護(hù)劑提供理論基礎(chǔ)。