葛 萌

隨著世界人口老齡化現(xiàn)象逐漸加重，骨質(zhì)疏松(OP)的發(fā)病率逐年增加[1]。骨質(zhì)疏松作為常見的骨科疾病，其主要臨床表現(xiàn)為骨量急劇降低、骨微觀結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重、骨脆性增加，且好發(fā)于老年人和絕經(jīng)后女性[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)，年齡大于50歲的人群中，1/3的女性患有骨質(zhì)疏松，而1/5的男性患有骨質(zhì)疏松[3]。目前我國骨質(zhì)疏松患者總數(shù)高達(dá)1.4億，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量[4，5]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病原因主要是骨吸收與骨形成失衡，成骨細(xì)胞的分化和功能活性在骨形成中發(fā)揮重要作用，大多數(shù)成骨細(xì)胞是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化而來[6]。因此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性和成骨分化在骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

microRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于真核生物體中、長度約為22～25個(gè)核苷酸的、內(nèi)源性非編碼單鏈RNA[7]。miRNA對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，miRNAs可通過與靶mRNA特異性結(jié)合從而誘導(dǎo)其降解或翻譯抑制，進(jìn)而能夠參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[8]。近年來相關(guān)研究表明，一些miRNAs可參與骨形成過程，且調(diào)控骨相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[9～11]。因此，本文研究miR-144在骨質(zhì)疏松患者護(hù)理過程中的變化及其對骨質(zhì)疏松作用，為進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松及相關(guān)護(hù)理提供一個(gè)新方向和新思路。

1.資料與方法

1.1 臨床樣本 選取2018年1月至12月在我院接受治療的60例骨質(zhì)疏松患者作為研究組，年齡范圍為50～80歲，平均年齡(57.13±13.45)歲，男性30例，女性30例。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡大于50歲；符合《中國人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)》(第二稿)中骨質(zhì)疏松相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；精神正常；依從性高。排除標(biāo)準(zhǔn):患有影響骨代謝的疾?。唤诜每赡芨蓴_骨代謝的藥物；惡性腫瘤患者；合并有心腦血管嚴(yán)重疾病者；肝、腎功能檢查異常者。此外，選取同期在我院進(jìn)行健康體檢的60例健康志愿者作為對照組。

于清晨收集兩組患者空腹靜脈血6ml，應(yīng)用超高速離心機(jī)(Thermo，美國)，室溫條件下，轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心10min，以分離血清，將血清置于-80℃超低溫冰箱(Thermo，美國)中保存。此外，收集骨質(zhì)疏松患者接受護(hù)理治療前、治療2周、4周、6周、8周時(shí)的血清樣本，檢測miR-144的表達(dá)情況。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均自愿參與本課題并簽署書面知情同意書。

1.2 護(hù)理干預(yù)方法 60例骨質(zhì)疏松患者接受常規(guī)護(hù)理干預(yù)和綜合護(hù)理。常規(guī)護(hù)理主要包括：①密切觀察患者病情，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生；②積極與患者溝通，及早了解患者心理變化，并為其排解擔(dān)憂；③指導(dǎo)患者正確飲食，囑患者進(jìn)食鈣含量豐富的食物，并提醒患者按時(shí)服藥；③對患者進(jìn)行防跌倒有關(guān)策略指導(dǎo)。

綜合護(hù)理干預(yù)，主要包括：①多與患者進(jìn)行溝通和交流，反復(fù)講解患者日常生活中需要注意的事情，及時(shí)給予有效的指導(dǎo)，加強(qiáng)患者信心；②定期針對患者開展健康知識講座，幫助患者了解骨質(zhì)疏松的病因及治療的重要性；③指導(dǎo)患者進(jìn)行適當(dāng)?shù)穆艿儒憻?，以進(jìn)行功能鍛煉；④指導(dǎo)患者如何緩解疼痛，如進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆潘捎?xùn)練及轉(zhuǎn)移注意力等；⑤出院后針對患者情況制訂詳細(xì)的干預(yù)計(jì)劃，對患者運(yùn)動、飲食及用藥情況進(jìn)行電話監(jiān)督和提醒。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人BMSCs購于中國賽業(yè)公司，采用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液(Hyclone，美國)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并將細(xì)胞置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱(Thermo，美國)中培養(yǎng)。每3天更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將人BMSCs接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中(康寧，美國)，應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000(Invitrogen，美國)和無血清Opti培養(yǎng)基(Hyclone，美國)進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)染，分組分別為miR-144mimic、mimic-NC、miR-144 inhibitor、inhibitor-NC組，24h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time qPCR) 應(yīng)用TRIzol溶液(Thermo，美國)裂解細(xì)胞RNA，充分裂解后，提取總RNA。加入10μl體積的DEPC水溶解RNA沉淀后，置于Nanodrop儀器檢測RNA純度和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI，美國)說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用Real-time PCR儀(ABI，美國)，采用SYBR染料(羅氏，德國)檢測miR-144的表達(dá)情況。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將人BMSCs接種于96孔板中(康寧，美國)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-144后，進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性。96孔板每孔加入10μl體積的CCK-8溶液和100μl體積的無血清培養(yǎng)基，避光孵育1h后，將孔板置于酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)，在波長為450nm處檢測吸光度值(OD)。

1.7 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化 待人BMSCs匯合度達(dá)到約50%時(shí)，將人BMSCs向成骨方向誘導(dǎo)分化，采用含有50μg/ml抗壞血酸、10mmol/Lβ-磷酸甘油和10-7mmol/L地塞米松的DMEM培養(yǎng)液(Hyclone，美國)，每3天更換新鮮培養(yǎng)液，誘導(dǎo)21天后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.8 堿性磷酸酶(ALP)染色 人BMSCs向成骨方向誘導(dǎo)分化后，用PBS清洗細(xì)胞，并用4%多聚甲醛(索萊寶，中國)室溫條件下固定30min。參照試劑盒說明書(南京建成，中國)，孵育ALP染色孵育液。應(yīng)用去離子水洗滌3次，留少量的液體，并將細(xì)胞置于倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)下觀察，并拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)均采用Graphpad軟件進(jìn)行處理，兩組間比較采用配對t檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松患者中miR-144的表達(dá) 與正常對照組(n=60)相比，骨質(zhì)疏松患者(n=60)血清中miR-144的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0004，圖1)。

圖1 正常人和骨質(zhì)疏松患者血清中miR-144的表達(dá)

2.2 骨質(zhì)疏松患者接受護(hù)理過程中miR-144的表達(dá)變化 與護(hù)理干預(yù)前相比，骨質(zhì)疏松患者(n=60)接受護(hù)理干預(yù)過程中，患者血清中miR-144的表達(dá)逐漸增高，且在護(hù)理8周時(shí)表達(dá)最高(圖2)。

圖2 骨質(zhì)疏松患者接受護(hù)理干預(yù)過程中miR-144的表達(dá)情況

2.3 miR-144對人BMSCs活性的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-144mimic顯著提高人BMSCs活性，而miR-144 inhibitor顯著抑制人BMSCs活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0012和P=0.0011，圖3A和圖3B)。

圖3 miR-144調(diào)控人BMSCs活性

2.4 miR-144對人BMSCs成骨分化的影響 ALP染色結(jié)果表明，miR-144mimic顯著促進(jìn)人BMSCs向成骨方向分化，而miR-144 inhibitor顯著抑制人BMSCs向成骨方向分化(圖4A和4B)。

圖4 miR-144調(diào)控人BMSCs成骨分化能力

3.結(jié)論

miRNAs是內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其可以調(diào)控人類約1/3基因的表達(dá)[13]。據(jù)報(bào)道，miRNAs在骨形成和骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，進(jìn)而參與骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病的進(jìn)程[14]。例如，周翔等人發(fā)現(xiàn)miR-590抑制老年骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化，敲減miR-590可能成為臨床治療老年骨質(zhì)疏松的新方法[15]。張揚(yáng)等人發(fā)現(xiàn)，miR-98-5p對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和小鼠骨缺損恢復(fù)有促進(jìn)作用，通過調(diào)控miR-98-5p表達(dá)的方式或許可以用于治療日常病理性骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨損傷恢復(fù)[16]。然而，針對miRNA與骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展及患者接受護(hù)理干預(yù)的研究并不完善。因此，本文研究miR-144在骨質(zhì)疏松患者護(hù)理過程中的變化及其對骨質(zhì)疏松作用，為進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松及相關(guān)護(hù)理提供一個(gè)新方向和新思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，骨質(zhì)疏松患者血清中miR-144的表達(dá)顯著降低；骨質(zhì)疏松患者接受護(hù)理干預(yù)過程中，患者血清中miR-144的表達(dá)逐漸增高，且在護(hù)理8周時(shí)表達(dá)最高；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-144mimic顯著提高人BMSCs活性，而miR-144 inhibitor顯著抑制人BMSCs活性；ALP染色結(jié)果表明，miR-144 mimic顯著促進(jìn)人BMSCs向成骨方向分化，而miR-144 inhibitor顯著抑制人BMSCs向成骨方向分化。因此，我們認(rèn)為miR-144在骨質(zhì)疏松患者中表達(dá)降低，護(hù)理干預(yù)后miR-144的表達(dá)顯著升高，且其能夠調(diào)控人BMSCs活性和成骨分化能力。

綜上所述，miR-144在骨質(zhì)疏松患者中表達(dá)降低，護(hù)理干預(yù)后miR-144的表達(dá)顯著升高，且過表達(dá)miR-144能夠提高人BMSCs活性和成骨分化能力，通過調(diào)控miR-144表達(dá)可能可以治療骨質(zhì)疏松，為臨床骨質(zhì)疏松的治療提供新的思路。