陳 超 張 逸 任郭子君 張嘉禧 楊 澤 余鈺琨※

阿爾茲海默癥(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病(HD)等神經(jīng)變性疾病是目前常見的中老年人慢性疾病。這些疾病的共同病理特征是與神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)功能喪失、血腦屏障功能障礙有關(guān)，伴隨突觸和神經(jīng)細(xì)胞減少、腦部氧化損傷和炎癥反應(yīng)增加[1]。其關(guān)鍵病理生理過程涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常和錯誤折疊等[2]。而神經(jīng)元功能紊亂的主要因素為生化因素(細(xì)胞死亡、細(xì)胞微環(huán)境變化、各細(xì)胞間互相作用)和機(jī)械因素(硬度、剪切力、間隙流動)。目前，神經(jīng)變性疾病的治療頗為困難。在新藥研究上，常見神經(jīng)變性疾病模型受限于不能完全模擬患者體內(nèi)生理狀態(tài)，其藥物篩選、毒理測試功能難以充分發(fā)揮，而3D細(xì)胞模型可提供復(fù)雜的微環(huán)境，更接近患者的真實環(huán)境，使細(xì)胞模型使用效率提高，因此3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)在未來神經(jīng)變性疾病藥物研發(fā)市場中可能被大規(guī)模應(yīng)用。本綜述將介紹常見神經(jīng)變性疾病現(xiàn)有模型、3D細(xì)胞培養(yǎng)體系、體外模擬這些疾病的障礙和當(dāng)前在該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1.神經(jīng)變性疾病現(xiàn)有模型

神經(jīng)變性疾病模型主要應(yīng)用于藥物毒理測試和有效性篩選，通常分為體內(nèi)模型和體外模型[3]。

1.1 體內(nèi)模型 體內(nèi)模型(動物模型)分為嚙齒動物模型和大型動物模型，一般以過表達(dá)的人類突變基因或者化學(xué)誘導(dǎo)來構(gòu)建。嚙齒動物模型的特征是繁殖周期較短，在不同類型的神經(jīng)變性疾病中應(yīng)用較廣。例如AD的APPSL/PSEN1小鼠模型[4]、HD的R6/2小鼠模型[5]、多巴胺能神經(jīng)毒素(1-Methy-4-pheny-1，2，3，6-tetrahydrop，MPTP)處理的PD小鼠模型[6]等。大型動物模型的特征是壽命長且與人的同源性較高，病理接近。例如，表達(dá)β-淀粉樣前體蛋白的非人靈長類動物會出現(xiàn)認(rèn)知功能輕度減退的特點[7]，表達(dá)亨廷頓蛋白(Huntingtin，HTT)時出現(xiàn)腦張力障礙的表征[8]，而靜脈注射MPTP會誘導(dǎo)這類動物出現(xiàn)帕金森樣癥狀，比如黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少、路易小體表達(dá)等[9]。

1.2 體外模型 體外模型常分兩種：腦組織切片培養(yǎng)模型和2D細(xì)胞培養(yǎng)模型。腦組織切片培養(yǎng)模型又稱為腦片培養(yǎng)，這類模型的特征是保留了大腦三維結(jié)構(gòu)及神經(jīng)組織生長的微環(huán)境，能廣泛應(yīng)用于模擬PD病理特性[10]，但培養(yǎng)時間不長，難以適應(yīng)藥物測試需求。2D細(xì)胞培養(yǎng)模型是目前最常用的體外模型，具有成本低、易操作的特點，常以新生的腦細(xì)胞為基礎(chǔ)。例如，利用胎鼠或胚胎干細(xì)胞來源的多巴胺能神經(jīng)元來構(gòu)建PD體外模型。Sawada等[11]就利用了這種PD體外模型，研究中腦內(nèi)雌激素在多巴胺神經(jīng)元凋亡過程中的作用。

1.3 現(xiàn)有模型的缺陷 常見神經(jīng)變性疾病現(xiàn)有模型對藥物臨床前研究到臨床轉(zhuǎn)化的過程具有重要的意義，但是這些常見神經(jīng)變性疾病現(xiàn)有模型都存在缺陷。動物模型與患者存在明顯的種間遺傳差異，臨床模擬程度較低，并涉及成本和倫理問題，促使人們研究低成本、高質(zhì)量的細(xì)胞模型。腦片培養(yǎng)模型雖然保留了大腦局部的組織結(jié)構(gòu)，但是腦切片實驗造價較高，厚度較薄的腦切片容易缺氧壞死，利用這種模型進(jìn)行藥物毒理性實驗易受限制[12]。2D細(xì)胞模型以單層細(xì)胞形式生長的細(xì)胞組成，而腦細(xì)胞在人類腦部以3D細(xì)胞形態(tài)存在，這種細(xì)胞模型無法近似模擬神經(jīng)變性疾病患者體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和細(xì)胞活動，預(yù)測細(xì)胞反應(yīng)的精準(zhǔn)度較差。相比之下，體外模型中的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型近年來備受關(guān)注。以3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，從患者體內(nèi)獲取體細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞，培養(yǎng)分化成神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞)后，通過體外重建三維的ECM模擬腦部神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，構(gòu)建3D神經(jīng)變性疾病模型，更有利于新型藥物靶標(biāo)的確定、高通量藥物的藥理檢測和篩選。

2. 3D細(xì)胞培養(yǎng)體系

3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系是神經(jīng)組織再生、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的新希望，不僅能模擬人類腦部高度組織化的ECM和高度復(fù)雜化的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，而且能反映血腦屏障功能變化和炎癥反應(yīng)[13]，更可構(gòu)建出綜合性神經(jīng)變性疾病模型。3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系分成兩大類：無支架系統(tǒng)和支架系統(tǒng)。無支架系統(tǒng)主要是通過物理方法，使細(xì)胞自發(fā)性的組裝或黏附形成球狀體形態(tài)，并自身分泌ECM維持3D細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[14]。支架系統(tǒng)主要是將細(xì)胞接種或分散于體外可見的ECM支架，自組裝成三維形態(tài)的細(xì)胞，這類系統(tǒng)包括脫細(xì)胞支架、水凝膠支架、微流控芯片、固體多孔支架、纖維支架等，可通過生物化學(xué)、機(jī)械信號促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。

2.1 無支架細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 無支架系統(tǒng)最明顯的特征是無須外界添加任何生物、化學(xué)材料，以細(xì)胞本身分泌的天然ECM為3D細(xì)胞培養(yǎng)支撐體系，使細(xì)胞聚集成3D球形團(tuán)塊[15]。利用無支架系統(tǒng)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)細(xì)胞主要有以下方法：懸滴培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器或軌道搖床、磁懸浮培養(yǎng)、超低黏附細(xì)胞培養(yǎng)。有研究表明，球狀體細(xì)胞是構(gòu)建3D神經(jīng)變性疾病模型的潛在條件，他們通過旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器或者軌道搖床的物理方法，模擬大腦皮層內(nèi)神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)回路，突破細(xì)胞間功能交流障礙，并有效地促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣在3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)過程中充分交換[16]。另外一些研究人員采用基于磁懸浮原理的3D細(xì)胞培養(yǎng)體系，培養(yǎng)出三維結(jié)構(gòu)的神經(jīng)干細(xì)胞，主要是通過絲狀噬菌體、磁性氧化鐵、金納米顆粒構(gòu)成的復(fù)合物，與細(xì)胞表面的IgE-Fc1RⅠ受體結(jié)合促使細(xì)胞磁化后，在外加磁場的誘導(dǎo)下，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮程度并誘導(dǎo)細(xì)胞聚集成三維的神經(jīng)球[17]。Zablotskii等[18]認(rèn)為外施加的磁場可高效模擬細(xì)胞微環(huán)境，保持細(xì)胞黏附和活性，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖速度和定向分化的功能。

2.2 支架細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

2.2.1 脫細(xì)胞支架：脫細(xì)胞支架以腦部組織為材料，通過機(jī)械、化學(xué)方法有效去除細(xì)胞成分，最大限度保留天然、易降解、復(fù)雜結(jié)構(gòu)的ECM[19]。常用的機(jī)械手段有快速冷凍、超聲、機(jī)械攪拌等。其中快速冷凍腦部組織可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶體形成，結(jié)晶體破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞溶解，保留天然ECM支架作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的基礎(chǔ)[20]。但細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的碎片可能會污染沉積的ECM，故需要嚴(yán)格控制溫度大小，以免結(jié)晶體直接破壞ECM結(jié)構(gòu)。常用的化學(xué)手段有乙酸、硫酸、離子型去污劑等。去細(xì)胞處理、消化后形成含有多種生長因子的液態(tài)ECM，可通過注射方法注入細(xì)胞板形成凝膠，腦組織依賴這種天然凝膠自組裝成立體結(jié)構(gòu)[21]。雖然脫細(xì)胞支架培養(yǎng)的腦組織，在構(gòu)建神經(jīng)變性疾病的藥物模型時免疫排斥反應(yīng)相對不明顯，但易受到污染和破壞，構(gòu)架完整性和穩(wěn)定性較差，而后面闡述的支架在構(gòu)建疾病模型中較為穩(wěn)定。

2.2.2 水凝膠支架：水凝膠支架采用天然材料、合成材料和復(fù)合材料搭建，通過化學(xué)方法或物理交聯(lián)結(jié)合成3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)模擬腦部ECM。這類支架的特點是高含水量、高孔隙[22]。天然材料根據(jù)性質(zhì)分為生物可降解水凝膠和生物活性水凝膠。前者結(jié)構(gòu)變化幅度較小，可自發(fā)性調(diào)節(jié)天然水凝膠支架結(jié)構(gòu)。例如聚氨酯水凝膠構(gòu)成的晶格結(jié)構(gòu)在37℃下自發(fā)交聯(lián)，Hsieh等[23]用其構(gòu)建神經(jīng)變性疾病模型。而后者需要水凝膠前體和ECM衍生信號共同模擬腦部ECM的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。ECM衍生信號是一種生物活性分子，可分為四大類：多糖及蛋白多糖(海藻酸、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、殼聚糖等)[24]、細(xì)胞黏附蛋白(明膠、玻連蛋白、膠原蛋白、纖維蛋白凝集素、層粘連蛋白等)[25]、生長因子(神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等)[26]、形態(tài)發(fā)生素(骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、視黃醇、音猬因子等)[27]。盡管天然水凝膠更接近腦部ECM(透明質(zhì)酸與層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原、玻連蛋白、腱糖蛋白、蛋白聚糖等組成)[28]，但是存在免疫排斥的風(fēng)險，構(gòu)建神經(jīng)變性疾病模型可能受到限制。

合成材料構(gòu)成水凝膠支架的特征是具有一定的彈性、生物降解性[3]。如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚左旋乳酸、嵌段共聚物，可通過改變?nèi)斯ず铣刹牧系姆肿恿看笮『徒宦?lián)密度來調(diào)節(jié)生物降解率[26]。有研究者利用多孔微結(jié)構(gòu)的聚左旋乳酸合成支架，使神經(jīng)干細(xì)胞免受宿主免疫排斥和壞死的侵害，促進(jìn)細(xì)胞存活和分化，在多數(shù)仿生ECM支架的研究、神經(jīng)變性疾病模型的構(gòu)建和臨床藥物的研發(fā)上有積極的意義[29]。

復(fù)合水凝膠支架是天然材料和合成材料從單一性變多樣性的組合性聚合物，神經(jīng)干細(xì)胞可根據(jù)定向分化的細(xì)胞類型需求，在不同的水凝膠中培養(yǎng)[30]。例如膠原-硫酸軟骨素支架、海藻酸鹽-明膠支架、纖維蛋白-透明質(zhì)酸支架、基質(zhì)膠(MatrigelTM支架)等。這些新型復(fù)合性水凝膠可增強(qiáng)細(xì)胞黏附性，有利于神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。有研究結(jié)果表明這類支架可模擬腦部神經(jīng)前體細(xì)胞遷移路徑，引導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞束對齊，可為構(gòu)建神經(jīng)變性疾病模型奠定細(xì)胞遷移基礎(chǔ)[31]。

2.2.3 微流控芯片：微流控芯片是光刻膠(如聚二甲基硅氧烷)通過光刻等微加工技術(shù)得到的微圖案結(jié)構(gòu)，由單個或多個微室組成，微室之間形成微通道或微凹槽陣列[32]。微流控芯片通常以包埋細(xì)胞的水凝膠為基礎(chǔ)，將水凝膠注射入微圖案結(jié)構(gòu)形成微流控平臺[33]。Hughes等[34]選擇MatrigelTM支架，并在凝化過程中，凝膠沿著液體流動方向?qū)R，引導(dǎo)神經(jīng)突整齊排列，形成神經(jīng)回路的腦類器官結(jié)構(gòu)，故微流控芯片簡稱“芯片上的大腦”。由于水凝膠具有生物惰性，需要通過調(diào)節(jié)生化仿生梯度(細(xì)胞濃度、ECM組成濃度、細(xì)胞因子濃度)和機(jī)械信號(彈性模量、基質(zhì)硬度梯度)，額外添加被整合素受體識別的ECM衍生蛋白或短肽(RGD序列、IKVAV序列、YIGSR序列)[35～37]，以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的長期存活，有利于檢測不同細(xì)胞類型的細(xì)胞間交流功能和相互作用，可利用多電極、鈣成像、光刺激等技術(shù)監(jiān)測微流控平臺中的神經(jīng)活動。最新研究發(fā)現(xiàn)，微流控芯片也可在無支架系統(tǒng)中實現(xiàn)神經(jīng)球的培養(yǎng)，利用懸滴技術(shù)和微流控平臺共同制作的芯片[38]，為研究神經(jīng)變性疾病提供新的方向，更有利于有效構(gòu)建神經(jīng)變性疾病模型，可用于高通量篩選新型藥物或研究神經(jīng)發(fā)育過程。

2.2.4 固體多孔支架：雖然水凝膠支架和微流控芯片均提供了良好的腦部ECM微環(huán)境，但培養(yǎng)效率較低，而固體多孔支架融合了生物材料、生物活性分子和細(xì)胞，具有高孔隙率、高機(jī)械穩(wěn)定性[39]，實現(xiàn)了一步到位的自組裝系統(tǒng)，有利于營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和氣體交換，孔隙本身也可限制菌落大小，降低細(xì)胞死亡率。用于制作固體多孔支架的技術(shù)手段包括鹽浸、冷凍干燥、相分離、氣體發(fā)泡、3D打印等。3D打印是目前固體多孔支架中最常用的技術(shù)方法，可沉淀包含生物材料和細(xì)胞的生物墨水。3D打印將細(xì)分成光固化和基于擠出、液滴、激光等技術(shù)的打印，有利于更精確控制拓?fù)涮匦?孔徑、孔形、孔隙率)。Gu等[40]將瓊脂糖、羧甲基殼聚糖、藻酸鹽共同組成的生物墨水與神經(jīng)干細(xì)胞結(jié)合后，可打印出多孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，并證明這類技術(shù)制作的固體多孔支架可支持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。

2.2.5 纖維支架：纖維支架是水凝膠支架的延伸，通常利用水凝膠支架中的天然、合成材料，通過相分離、自組裝、靜電紡絲等技術(shù)合成纖維支架[41]。靜電紡絲技術(shù)制作的纖維支架常用于3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，例如電紡聚乳酸纖維支架、電紡明膠纖維支架、電紡聚己內(nèi)酯纖維支架等可作為3D培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞的基礎(chǔ)。

構(gòu)建體外模型的過程中，患者來源的神經(jīng)干細(xì)胞可通過上述基于水凝膠材料的水凝膠支架、微流控芯片、固體多孔支架和纖維支架，形成類似于腦部神經(jīng)細(xì)胞類型、結(jié)構(gòu)和功能的三維聚集體，簡稱“腦類器官”[42]。與無支架系統(tǒng)中形成的球狀體相比，腦類器官依賴水凝膠材料提供的ECM微環(huán)境，模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)，對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化起著重要調(diào)節(jié)作用。在構(gòu)建神經(jīng)變性疾病模型過程中，3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系可高效體外模擬AD、PD、HD等疾病的障礙，該領(lǐng)域的最新研究成為藥物高通量篩選和毒理測試的潛在基礎(chǔ)[43]。

3 體外構(gòu)建神經(jīng)變性疾病的3D神經(jīng)細(xì)胞模型

神經(jīng)變性疾病是由基因突變、多因素遺傳、環(huán)境風(fēng)險等因素引起[44]。新藥研究的關(guān)鍵是要尋找精準(zhǔn)度高的疾病模型，從而為高通量篩選、藥理毒理測試奠定基礎(chǔ)[28]。

3.1 阿爾茲海默癥3D神經(jīng)細(xì)胞模型 AD是最為普遍的癡呆類神經(jīng)變性疾病，患者常表現(xiàn)出記憶、語言、理解能力漸進(jìn)性喪失，直至后期完全性認(rèn)知障礙而死亡[45]。至今為止仍未有藥物能有效阻止疾病的發(fā)生，僅有少數(shù)上市藥物可緩解早期患者的短期癥狀。大多數(shù)患者患有散發(fā)性AD(SAD)。SAD與罕見的早發(fā)、家族性AD(FAD)的致病因素不同。SAD涉及了多因素遺傳和環(huán)境風(fēng)險因素，而FAD主要是由(APP、PSEN1、PSEN2)基因突變所引起，簡稱F突變[3]。

早期階段FAD的病理標(biāo)志體現(xiàn)在神經(jīng)元減少，涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平升高、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和糖基化改變、致病性β-淀粉樣蛋白(Aβ)過度蓄積、高度磷酸化的微管相關(guān)蛋白(p-tau)沉積等病變過程[46]。FAD關(guān)鍵病理標(biāo)志是Aβ斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成(NFTs)。盡管單個或多個F突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型重現(xiàn)了Aβ斑塊及Aβ蛋白誘導(dǎo)的突觸缺失，2D細(xì)胞模型也出現(xiàn)了Aβ蛋白增長的趨勢[46]，但它們均缺乏p-tau驅(qū)動的NFTs、高水平的致病Aβ蛋白、成熟老化的神經(jīng)元等關(guān)鍵病理標(biāo)志。主要原因是動物模型內(nèi)源性的tau蛋白抑制了患者外源性tau蛋白的聚集和磷酸化，例如PDAPP小鼠[47]。而在2D細(xì)胞模型中，因為需要定期更換培養(yǎng)液，Aβ蛋白無法聚集，且由于Aβ42水平過低，無法形成Aβ斑塊及AD致病級聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)的NFTs。3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系提供相對封閉的微環(huán)境，可引發(fā)Aβ蛋白聚集和包括NFTs在內(nèi)的AD致病級聯(lián)反應(yīng)。例如選擇MatrigelTM支架提供腦樣環(huán)境，患者來源的F突變神經(jīng)細(xì)胞通過Aβ染料Amylo-Glo和Aβ免疫染色方法，可觀察到細(xì)胞外存在Aβ蛋白沉積現(xiàn)象，而利用β/γ-分泌酶抑制劑，可減少Aβ蛋白并減弱磷酸化的p-tau蛋白，可觀察3D細(xì)胞模型重演Aβ蛋白和NFTs涉及的病理過程[46]。另有報道利用F突變、神經(jīng)干細(xì)胞來源的小膠質(zhì)細(xì)胞，通過微流控芯片體外構(gòu)建AD模型，其中小膠質(zhì)細(xì)胞被Aβ蛋白激活產(chǎn)生一系列的促炎分子(IL-1、IL-6和TNF-α)，影響神經(jīng)元損傷和Aβ蛋白沉積[48]。針對AD疾病模型，將2D培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞移植到包含Aβ蛋白溶液的微流控芯片內(nèi)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在芯片內(nèi)部凹形微孔結(jié)構(gòu)中自我聚集，形成神經(jīng)球并短時間內(nèi)分化完全[49]。

雖然目前中老年人患病趨勢更多地被劃分為SAD，但是由于SAD致病因素可控性差，相比FAD，SAD疾病模型嚴(yán)重缺乏。曾有研究者從SAD患者中抽取體細(xì)胞，基于3D細(xì)胞培養(yǎng)體系使其誘導(dǎo)分化成神經(jīng)球，檢測到僅有少數(shù)神經(jīng)元顯示Aβ水平較高，且β/γ-分泌酶抑制劑無明顯降低Aβ斑塊的作用[50]。3D細(xì)胞模型可能無法模擬SAD發(fā)病病理，構(gòu)建SAD神經(jīng)細(xì)胞模型仍需進(jìn)一步的研究和探討。

圖1 3D培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞源性的神經(jīng)細(xì)胞在神經(jīng)變性模型中的應(yīng)用

3.2 帕金森病3D神經(jīng)細(xì)胞模型 全球第二大的神經(jīng)變性疾病是運(yùn)動障礙類的PD。PD患者典型癥狀表現(xiàn)為失控性震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩、身體重心失衡[51]。該疾病與上述AD疾病類似，可細(xì)分為家族性PD和散發(fā)性PD，而大多數(shù)患者屬于散發(fā)性PD，主要致病因素是與路易小體中的ɑ-突觸核蛋白(ɑ-syn)錯誤折疊有關(guān)[52]。在遺傳因素和環(huán)境因素的影響下，天然ɑ-syn錯誤折疊、轉(zhuǎn)化成低聚物和纖維，最終異常聚集、沉積形成路易小體，是散發(fā)性PD獨特病理特征。患者占少數(shù)的家族性PD與ɑ-syn基因組成SNCA的點突變有關(guān)[53]。PD的病理學(xué)特征包括線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、路易小體形成、中腦黑質(zhì)致密部內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元(mDA)缺失等，但mDA丟失的確切病理機(jī)制還未清楚。目前非靈長類動物(如貓、綿羊、豬)和靈長類動物模型還不能反饋mDA缺失的帕金森樣狀態(tài)。國內(nèi)研究小組曾利用CRISPR/Cas9技術(shù)，產(chǎn)生具有三基因(parkin/DJ-1/PINK1)突變的豬PD模型，但是后期臨床實驗并不符合模型預(yù)期[54]。

利用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的PD模型，主要模擬散發(fā)性PD病理特征。有研究者利用3D培養(yǎng)體系形成高度組織化的ECM空間，從神經(jīng)干細(xì)胞中培養(yǎng)分化獲得mDA、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并有突觸連接和自發(fā)性神經(jīng)活動。3D培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞源性的神經(jīng)細(xì)胞，可切實反映腦部神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)和功能，有可能模擬PD功能障礙。例如Freundt等[55]利用微流控芯片的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢，在凹陷槽孔中置入包含ɑ-syn的纖維材料，將PD患者來源的神經(jīng)細(xì)胞整合到微流控體系中。3D培養(yǎng)的神經(jīng)元移動方向具有相對齊性。在原有微流控芯片基礎(chǔ)上，添加微閥控制芯片上凹槽的液體流速，可使PD模型更加貼近疾病病理特征[13]。

3.3 亨廷頓舞蹈病3D神經(jīng)細(xì)胞模型 HD是不可治愈的遺傳性神經(jīng)變性疾病。HD患者的典型特征是肢體不自主運(yùn)動、人格變化、認(rèn)知功能障礙甚至喪失[56]，主要病因是HTT基因中CAG重復(fù)，導(dǎo)致毒性HTT擴(kuò)增、紋狀體中等棘狀神經(jīng)元丟失，影響大腦周圍區(qū)域發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化。與AD類似，市場上HD的藥物只能緩解早期癥狀。在藥物臨床檢測過程中，R6/2模型是常用的小鼠HD模型，包含了120個CAG重復(fù)序列的突變體，表型上也重現(xiàn)了HD的典型特征[57]。而構(gòu)建更為經(jīng)濟(jì)的3D神經(jīng)干細(xì)胞來源的HD模型的主要難點在于高度復(fù)雜化紋狀體神經(jīng)環(huán)路的重新構(gòu)建[43]。

在3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，所利用的生物材料可增強(qiáng)紋狀體神經(jīng)干細(xì)胞的快速分化[58]，通過機(jī)械、化學(xué)信號構(gòu)建的ECM微環(huán)境，可影響紋狀體神經(jīng)干細(xì)胞分化的細(xì)胞類型、黏附程度和增殖速度。有研究顯示，彈性模量較大的支架有利于分化成紋狀體神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而彈性模量較小的支架有利于分化成紋狀體神經(jīng)元[59]。例如Tang-Schomer等[60]通過控制不同機(jī)械硬度的支架與絲蛋白水凝膠材料共同構(gòu)建類器官樣的HD模型可獲得分化不同的細(xì)胞。目前利用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建HD模型的案例較少，但是未來HD模型的發(fā)展更趨向于利用3D細(xì)胞培養(yǎng)體系構(gòu)建HD模型，該模型更有利于研究紋狀體神經(jīng)元及其神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用、準(zhǔn)確模擬HD疾病的生理學(xué)、病理學(xué)特征。

4. 3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用于體外模型的局限和展望

3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系高效、利于快速檢測和篩選新型藥物，是疾病模型和藥物臨床前實驗的重要工具[43]。盡管3D神經(jīng)變性疾病模型有可能成功模擬疾病的病理發(fā)展過程，但是3D細(xì)胞模型缺乏血管化是三維神經(jīng)組織培養(yǎng)的最大挑戰(zhàn)。血管在氣體交換、營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、廢物清除中起著關(guān)鍵作用[45]，僅有少數(shù)微流控芯片系統(tǒng)能初步模擬血流的介質(zhì)灌注流和組織血管化過程[13,61]。在培養(yǎng)較大的球狀體或類器官過程中，無法長期培養(yǎng)疾病模型從而限制藥物篩選應(yīng)用。此外，3D培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏老化現(xiàn)象[62]，不利于構(gòu)建晚期患者的疾病模型，無法進(jìn)行藥物功能性測試，而AD、PD、HD等神經(jīng)變性疾病患者常是晚期發(fā)病，故3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系所構(gòu)建的體外模型更多的被應(yīng)用于疾病早期藥物的篩選、檢測，晚期藥物實驗需動物模型支持。

3D培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞源性的神經(jīng)細(xì)胞可通過多種方法制備(如圖1)。構(gòu)建神經(jīng)變性疾病模型的3D細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)該考慮三個方面：一是共培養(yǎng)各種細(xì)胞類型同時，模擬大腦神經(jīng)組織網(wǎng)絡(luò)和血管網(wǎng)絡(luò)；二是外加動態(tài)的機(jī)械性能，例如設(shè)置梯度濃度引起液體流動；三是模擬復(fù)雜的大腦生理動態(tài)微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用和跨越神經(jīng)血管單元的功能障礙維護(hù)血腦屏障系統(tǒng)，更有利于該模型的模擬人類生理學(xué)和病理學(xué)，增加對疾病機(jī)理的理解。