黃琪淋，溫 莎，葉紹燕，萬逢潔，何 敏,

(1. 廣西壯族自治區(qū)龍?zhí)夺t(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，廣西 柳州 545005； 2. 廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣西 南寧 530021； 3. 柳州市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與學(xué)校衛(wèi)生防治所，廣西 柳州 545007； 4. 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染肺部形成的一種慢性傳染病，其中涂陰肺結(jié)核約占肺結(jié)核患者總數(shù)的一半[1]。涂陰肺結(jié)核患者早期不易被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，易漏診、誤診。然而，結(jié)核病的延遲診斷可能會(huì)增加疾病的嚴(yán)重程度和病死率，并加大傳播風(fēng)險(xiǎn)。在一項(xiàng)橫斷面調(diào)查[2]中發(fā)現(xiàn)，涂陰肺結(jié)核導(dǎo)致結(jié)核患者延遲治療風(fēng)險(xiǎn)比為2.3倍。在撒哈拉以南非洲地區(qū)的一項(xiàng)研究[3]中，涂陰肺結(jié)核患者對(duì)該地區(qū)的結(jié)核病控制項(xiàng)目構(gòu)成了巨大的負(fù)擔(dān)，其中三分之一的涂片陰性結(jié)核病患者在初診后一年內(nèi)死亡，三分之一患者可能發(fā)生復(fù)發(fā)性肺結(jié)核。因此，尋求一種靈敏度高、特異度強(qiáng)的涂陰肺結(jié)核血清標(biāo)志物是結(jié)核病研究關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來，血清蛋白組學(xué)技術(shù)為結(jié)核病的輔助診斷提供了契機(jī)[4]。本課題組前期血清蛋白組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)及血清淀粉樣蛋白4(serum amyloid A4，SAA4)在血清中的差異表達(dá)，并且目前在國內(nèi)外研究中除本課題組外尚未見有關(guān)血清SHBG及SAA4輔助診斷涂陰肺結(jié)核的相關(guān)報(bào)道，因此，本研究通過檢測(cè)涂陰肺結(jié)核血清潛在標(biāo)志物，即SHBG及SAA4在血清中的表達(dá)水平，并應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線進(jìn)一步評(píng)估兩項(xiàng)指標(biāo)的輔助診斷效能，為涂陰肺結(jié)核的輔助診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集2017年3—5月廣西柳州市龍?zhí)夺t(yī)院收治的88例涂陰肺結(jié)核患者的血清標(biāo)本，參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《臨床診療指南結(jié)核病分冊(cè)》[5]進(jìn)行涂陰肺結(jié)核患者的診斷，排除合并腫瘤、嚴(yán)重器質(zhì)性病變、免疫功能低下的肺結(jié)核患者。同一時(shí)期采集56例廣西柳州市本地區(qū)的健康體檢人員的血清標(biāo)本作為健康對(duì)照組，排除結(jié)核、肺炎、塵肺、腫瘤及其他嚴(yán)重肺部疾病患者。

1.2 血清SHBG、SAA4蛋白含量檢測(cè) 采集研究對(duì)象空腹時(shí)外周靜脈血3 mL，4℃靜置2 h，3 000 r/min離心5 min，取上層血清：(1)血清稀釋100倍后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法(試劑盒購于R&D Systems公司)檢測(cè)兩組血清SHBG蛋白含量；(2)血清稀釋10倍后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法(試劑盒購于LifeSpan BioSciences公司)檢測(cè)兩組血清SAA4蛋白含量。檢測(cè)過程均嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 近三年涂(菌)陰肺結(jié)核的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)檢測(cè)方法分析

1.3.1 檢索策略 檢索三大中文數(shù)據(jù)庫：萬方數(shù)據(jù)庫、中國知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施工程(中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫)、維普數(shù)據(jù)庫于2016年1月1日至今發(fā)表的中文文獻(xiàn)，按照下述條件進(jìn)行檢索：(涂陰肺結(jié)核 OR 菌陰肺結(jié)核)AND(靈敏度 OR 敏感度 OR 特異度)AND(T-SPOT OR ELISPOT OR 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) OR γ-干擾素釋放試驗(yàn))。

1.3.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者明確診斷為涂陰肺結(jié)核或菌陰肺結(jié)核；(2)應(yīng)用T-SPOT.TB檢測(cè)方法；(3)數(shù)據(jù)能直接提取四格表數(shù)據(jù)或經(jīng)計(jì)算得出四格表數(shù)據(jù)；(4)病例及對(duì)照樣本數(shù)均>40例；(5)文獻(xiàn)為中文期刊發(fā)表論文。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)無法提取四格表數(shù)據(jù)；(2)綜述或Meta類文獻(xiàn)；(3)數(shù)據(jù)有限的摘要文獻(xiàn)；(4)重復(fù)文獻(xiàn)。

1.4 涂陰肺結(jié)核血清學(xué)指標(biāo)診斷效能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)比較靈敏度、特異度、曲線下面積(area under curve，AUC)、約登指數(shù)指標(biāo)來評(píng)估各項(xiàng)研究中T-SPOT.TB檢測(cè)方法的涂陰肺結(jié)核診斷效能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25～P75)]表示，組間比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)。繪制ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積、靈敏度、特異度、約登指數(shù)。應(yīng)用MedCalc 16.2軟件進(jìn)行Z檢驗(yàn)，比較ROC曲線AUC的差異，進(jìn)而評(píng)價(jià)單一與聯(lián)合指標(biāo)診斷涂陰肺結(jié)核的診斷效能。采用卡方檢驗(yàn)分別進(jìn)行涂陰肺結(jié)核SHBG與SAA4兩者聯(lián)合診斷試驗(yàn)與近三年涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT.TB檢測(cè)方法的靈敏度和特異度比較。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 88例涂陰肺結(jié)核患者中男性51例，女性37例，平均年齡(49.49±16.13)歲；56例健康體檢人員中男性36例，女性20例，平均年齡(46.80±9.88)歲。兩組間年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，資料具有可比性。

2.2 血清SHBG與SAA4蛋白表達(dá)水平 ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示：涂陰肺結(jié)核組血清SHBG與SAA4蛋白濃度分別為52.32(24.58～81.19)nmol/L、56.71(41.87～77.57)ng/mL，健康對(duì)照組SHBG與SAA4蛋白濃度分別為25.97(16.60～36.45)nmol/L、35.79(29.81～41.07)ng/mL。涂陰肺結(jié)核組血清SHBG與SAA4蛋白表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。見圖1。

圖1 血清SHBG、SAA4蛋白的表達(dá)水平

2.3 SHBG、SAA4單一及聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的ROC曲線 對(duì)88例涂陰肺結(jié)核患者及56例健康對(duì)照組血清SHBG、SAA4蛋白的檢測(cè)結(jié)果繪制ROC曲線，結(jié)果表明兩指標(biāo)聯(lián)合診斷時(shí)曲線下面積AUC為0.906(95%CI:0.857～0.955)(P<0.001)。見表1、圖2。應(yīng)用Z檢驗(yàn)比較ROC曲線的結(jié)果如下：SHBG、SAA4兩者聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的效能明顯優(yōu)于單一指標(biāo)的診斷效能(P<0.001)，而比較SHBG、SAA4單項(xiàng)診斷涂陰肺結(jié)核時(shí)，兩蛋白指標(biāo)的單獨(dú)診斷效能差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 SHBG與SAA4聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的診斷效能

圖2 SHBG、SAA4單一及聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的ROC曲線

Figure2ROC curves of single and combined detection of SHBG, SAA4 for SNPT

2.4 近三年涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT.TB檢測(cè)方法分析 共檢索到102篇相關(guān)文獻(xiàn)，其中萬方數(shù)據(jù)庫79篇、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫20篇、維普數(shù)據(jù)庫3篇，按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入12篇中文文獻(xiàn)，排除90例，其中64篇無法提取四格表數(shù)據(jù)，11篇樣本例數(shù)少于40，3篇為綜述或Meta類文獻(xiàn)，10篇為重復(fù)文獻(xiàn)，2篇為非T-SPOT.TB檢測(cè)方法。從近三年已報(bào)道涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT.TB檢測(cè)方法的診斷效能來看，表2顯示各研究中的T-SPOT檢測(cè)技術(shù)在診斷肺結(jié)核時(shí)其診斷效能結(jié)果不一致，本研究的聯(lián)合診斷特異度不比T-SPOT.TB檢測(cè)方法差，在靈敏度上T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)除兩項(xiàng)研究比本研究的聯(lián)合診斷靈敏度高外，其他均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且本研究聯(lián)合診斷的約登指數(shù)為0.752，與這12項(xiàng)研究相比具備較好的準(zhǔn)確性，可見SHBG與SAA4兩者聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核具有比較優(yōu)勢(shì)。

3 討論

在結(jié)核病的流行過程中，相對(duì)于涂陽肺結(jié)核患者，涂陰肺結(jié)核患者的結(jié)核傳播率約為22%[18]，且肺結(jié)核病例中約有一半的涂片呈陰性[1]，意味著結(jié)核病的整體負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，將加大結(jié)核病的防控難度。因此，快速準(zhǔn)確地診斷涂陰肺結(jié)核病對(duì)于促進(jìn)疾病早期治療的開始，改善患者的預(yù)后和減少結(jié)核病傳播至關(guān)重要。近年來血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床疾病工作中，有研究[19]表明該項(xiàng)技術(shù)有助于結(jié)核病的輔助診斷，且血清學(xué)檢測(cè)對(duì)于痰量達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)的患者(如兒童、HIV/AIDS患者)和肺外結(jié)核患者具有一定的優(yōu)勢(shì)。因此，迫切需要尋找一種應(yīng)用多項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)合診斷結(jié)核病的方法。

表2納入12篇文獻(xiàn)中近三年涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT檢測(cè)技術(shù)比較

Table2Comparison of T-SPOT detection technique of SNPT in 12 literatures in recent three years

第一作者病例組(例)對(duì)照組(例)靈敏度特異度約登指數(shù)李振生[6]170640.971* 0.652# 0.623郝興亮[7]66400.864 0.900 0.764何 莉[8]1947440.866 0.808 0.674任甜甜[9]168810.792 0.630# 0.421嚴(yán)松盛[10]1021000.794 0.640# 0.434楊映暉[11]491150.714 0.826 0.540彭 寧[12]135790.822 0.924 0.746周前選[13]185640.778 0.688# 0.466李愛英[14]1561440.955* 0.896 0.851蔡向敬[15]1142030.856 0.714# 0.570何梅芳[16]93400.849 0.900 0.749王甲甲[17]77890.8960.764#0.660

*：與SHBG+SAA4聯(lián)合診斷靈敏度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；#：與SHBG+SAA4聯(lián)合診斷特異度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

本課題組在前期研究中利用血清蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出了肺結(jié)核患者血清差異表達(dá)蛋白SHBG與SAA4，在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步鑒定了SHBG、SAA4蛋白在涂陰肺結(jié)核患者血清中均高表達(dá)，預(yù)示著該蛋白可能作為涂陰肺結(jié)核患者診斷血清學(xué)候選標(biāo)志物。因此，本研究運(yùn)用ROC曲線進(jìn)一步評(píng)價(jià)這兩種蛋白對(duì)涂陰肺結(jié)核的輔助診斷價(jià)值。在評(píng)估SHBG與SAA4蛋白單獨(dú)及聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核時(shí)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷效能明顯高于單個(gè)蛋白指標(biāo)的診斷效能，其中聯(lián)合診斷的ROC曲線下面積可達(dá)0.906(95%CI:0.857～0.955)，且靈敏度為84.1%，特異度可達(dá)91.1%。近年來，新的檢測(cè)技術(shù)γ-干擾素釋放試驗(yàn)已經(jīng)被引入到肺結(jié)核臨床診斷中且表現(xiàn)出較高的診斷價(jià)值，我國主要使用結(jié)核感染T-SPOT.TB試劑盒，該試驗(yàn)主要通過測(cè)定由結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素來判斷被檢者有無結(jié)核病或是否存在結(jié)核感染。與近三年的涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT.TB檢測(cè)方法比較，本研究的聯(lián)合診斷的特異度不比T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)差，在靈敏度上T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)除兩項(xiàng)研究比本研究的聯(lián)合診斷靈敏度高外，其他均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且本研究的約登指數(shù)0.752與納入的這12項(xiàng)研究的約登指數(shù)相比，具備較好的準(zhǔn)確性，表明該聯(lián)合診斷試驗(yàn)的真實(shí)性好，能較好地發(fā)現(xiàn)真正的涂陰肺結(jié)核患者，可見SHBG與SAA4兩者聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核具有比較優(yōu)勢(shì)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的聯(lián)合檢測(cè)SHBG、SAA4蛋白為涂陰肺結(jié)核患者提供了良好的輔助診斷價(jià)值。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)雖然本研究與周穎等[20]研究中應(yīng)用的SHBG蛋白檢測(cè)試劑盒均來自R&D公司，但兩項(xiàng)研究中SHBG單一指標(biāo)診斷涂陰肺結(jié)核的診斷效能存在差異，除了樣本的差異外，可能還與兩項(xiàng)研究購買的科研試劑盒由于批次不同而存在檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定的因素有關(guān)，可見，檢測(cè)試劑盒向臨床應(yīng)用推廣需實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)管理，以達(dá)到臨床指標(biāo)穩(wěn)定檢測(cè)的效果。

目前對(duì)于兩種蛋白引起肺結(jié)核患者體內(nèi)差異表達(dá)的作用機(jī)制尚不清楚。結(jié)核病被稱為消瘦性疾病，結(jié)核患者脂聯(lián)素水平增高[21]，脂聯(lián)素可以通過肝脂質(zhì)含量的變化水平上調(diào)肝細(xì)胞核因子-4A，最終促進(jìn)肺結(jié)核患者體內(nèi)SHBG的表達(dá)增加[22]。SAA4是一種組成型蛋白，屬于SAA蛋白家族，可作為對(duì)損傷或炎癥本身的反應(yīng)產(chǎn)物，SAA4蛋白被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌及卵巢癌中表達(dá)增加[23-24]，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展；同時(shí)De等[4]通過SOMAscan蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)對(duì)來自于7個(gè)結(jié)核病流行國家的血清標(biāo)本進(jìn)行了深入分析，篩選出了結(jié)核患者722種差異表達(dá)蛋白，其中SAA蛋白在結(jié)核患者中表達(dá)增加，且與非結(jié)核患者相比，該蛋白的中位數(shù)倍數(shù)變化最大，達(dá)7.99倍。在感染結(jié)核分枝桿菌期間，結(jié)核病患者響應(yīng)炎癥刺激引起機(jī)體血液高凝狀態(tài)[25]，有研究[26-27]表明，SAA的升高可能與這些患者慢性感染分枝桿菌引起機(jī)體凝血途徑活化與抗凝血受損相關(guān)。相比于De的研究，本研究準(zhǔn)確突出SAA蛋白家族里的SAA4蛋白在涂陰肺結(jié)核患者中的高表達(dá)和結(jié)核診斷價(jià)值。

鑒于本研究SHBG與SAA4蛋白聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核顯示出較高的靈敏度及特異度，下一步本課題組將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行兩種蛋白對(duì)涂陰肺結(jié)核聯(lián)合診斷效能的多中心評(píng)價(jià)試驗(yàn)，為探討提高涂陰肺結(jié)核患者的診斷率以及輔助診斷提供經(jīng)濟(jì)、高效、實(shí)用的新方法。