動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，冠心病(CAD)是其主要疾病之一，冠心病又稱缺血性心臟病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(2014)報告，缺血性心臟病是全世界死亡的主要原因之一，每年700多萬人死于缺血性心臟病[1]。目前，中醫(yī)藥治療冠心病的研究取得了良好的療效。多項臨床實驗證明，養(yǎng)心氏片(YXS)治療冠心病療效較好，但其機制研究較少，本實驗研究養(yǎng)心氏片治療AS模型小鼠的可能作用機制，為其臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 雄性載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠40只，雄性C57BL/6J小鼠8只，均為SPF級，動物購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2014-0004。基礎(chǔ)飼料：由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。高脂飼料為購于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司的乳脂實驗動物純化飼料MD12015(21%乳脂，0.15%膽固醇)。

1.2 藥物及制備 養(yǎng)心氏片(由青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司提供，薄膜衣片，批號081204)，阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，薄膜衣片，批號H20051408)，將養(yǎng)心氏片或阿托伐他汀鈣片研磨后溶解于蒸餾水中，配制成濃度為0.140 g/mL、0.070 g/mL、0.035 g/mL的養(yǎng)心氏片高、中、低劑量組及濃度為0.257 mg/mL的阿托伐他汀鈣片，按動物體重給藥，每10 g動物給藥0.1 mL。

1.3 試劑及儀器 FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒[批號KR116，天根生化科技(北京)有限公司]；動物組織總RNA提取試劑盒[批號DP431，天根生化科技(北京)有限公司]；SuperReal熒光定量預(yù)混試劑 [批號FP205，天根生化科技(北京)有限公司]；DNA酶1[批號RT411，天根生化科技(北京)有限公司]；β-巰基乙醇(天津市江天化工技術(shù)有限公司)；紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號756MC)；Veriti PCR 熱循環(huán)儀(美國ABI公司，型號4375786)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號7500fast)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號BH-2)；體視鏡(德國，LEICA公司)；LEICA CM1900組織包埋機(德國Leica公司)；低速離心機(北京京立離心機有限公司，型號LDZ5-2)；引物由上海生物工程有限公司設(shè)計及合成。

1.4 動物造模及給藥 8周齡雄性C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠，均飼養(yǎng)于天津市人民醫(yī)院動物房小鼠飼養(yǎng)籠內(nèi)，每籠2只，飼養(yǎng)室恒溫(22±2)℃。人工光照明暗各12 h。所有小鼠在予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，C57BL/6J小鼠繼續(xù)予普通飼料喂養(yǎng)，ApoE-/-小鼠予高脂飼料喂養(yǎng)12周復(fù)制AS模型。ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)12周后，將其隨機分為模型組、養(yǎng)心氏片高劑量組、養(yǎng)心氏片中劑量組、養(yǎng)心氏片低劑量組、陽性對照組，每組8只。C57BL/6J小鼠8只作為正常對照組。給藥方法：養(yǎng)心氏片高、中、低劑量組分別給予1.40 g/(kg·d)、0.70 g/(kg·d)、0.35 g/(kg·d)，相當(dāng)于70 kg成人臨床劑量的2倍、1倍、0.5倍的養(yǎng)心氏片灌胃，陽性對照組給予2.57 mg/(kg·d)阿托代他汀鈣，相當(dāng)于成人20 mg/d臨床劑量的阿托伐他汀鈣片灌胃，每日1次；模型組及正常對照組給予等量的高溫滅菌蒸餾水灌胃，每日1次。灌胃時間為12周。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色及升主動脈斑塊校正后斑塊面積測定 灌胃12周后處死小鼠，小鼠處死后迅速打開胸腔，左心室逆行灌注液體至主動脈，鈍性分離主動脈(從升主動脈至髂動脈分叉處)，自頭臂干分叉處向近心端取主動脈0.3 cm(升主動脈)置于4%的多聚甲醛中固定，備做病理標(biāo)本。常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度5 μm，采用HE染色，用Image J 軟件檢測血管面積及斑塊面積。測量管腔面積(LA)、內(nèi)彈力膜圍繞面積(IELa)，計算斑塊面積(PA)及校正后斑塊面積。斑塊面積=IELa-LA， 校正后斑塊面積=PA/IELa。其余組動脈于-80 ℃冰箱保存。

1.5.2 實時熒光定量(qPCR)法檢測主動脈組織各因子 檢測核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA的表達(dá)。采用動物組織總RNA提取試劑盒提取小鼠主動脈組織總RNA，微量分光光度計檢測RNA樣品純度。然后按照反應(yīng)體系進行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR反應(yīng)體系及條件按試劑盒說明書進行。以GAPDH作為內(nèi)參照基因，GAPDH上游：5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′，GAPDH下游：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′；MCP-1上游： 5′-CCACTCACCTGCTGCTACTCATTC-3′，MCP-1下游：5′-CTGCTGCTGGTGATCCTCTTGTAG-3′；VCAM-1上游：5′-ATCTCAGGTGGCTGCACAAGTTG-3′，VCAM-1下游：5′-AGCGCACAGGTAAGAGTGTTCATC-3′；IL-6上游：5′-ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3′，IL-6：下游 5′-TTAAGCCTCCGACTTGTGAAGTGG-3′；TNF-α上游：5′-GCGACG TGGAACTGGCAGAAG-3′，TNF-α下游： 5′-GCCACAAGCAGGAATGAGAAGAGG-3′；NF-κB上游：5′-GACACGACAGAATCCTCAGCATCC-3′，NF-κB下游：5′-CCACCAGCA GCAGCAGACATG-3′；PCR反應(yīng)條件：95 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；循環(huán)40次。然后進行20 min的產(chǎn)物溶解程序，作溶解的曲線分析，將不同濃度的定量模板對數(shù)和相應(yīng)的CT值作圖。結(jié)果判定：△CT= CT- CTGAPDH。用各實驗組樣本的△CT減去正常對照組樣本的△CT，得到△△CT，以2-△△CT表示mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠升主動脈HE染色結(jié)果 正常對照組小鼠動脈管腔未見明顯改變，管壁外、中、內(nèi)膜3層結(jié)構(gòu)明顯，內(nèi)膜光滑無增厚，內(nèi)皮細(xì)胞完整連續(xù)，內(nèi)膜下無沉積的脂質(zhì)及斑塊形成，彈力板完整，中膜血管平滑肌細(xì)胞長呈梭形，整齊排列；模型組小鼠主動脈壁有明顯的斑塊形成，管腔狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞缺失或不完整，內(nèi)膜表面不光滑，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞浸潤，脂質(zhì)豐富，膽固醇結(jié)晶形成，有時可見斑塊破裂、出血、血栓形成。各藥物治療組主動脈亦可見內(nèi)膜增厚、斑塊形成，但與模型組相比較，斑塊病變減輕，斑塊面積減小，泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)減少，膽固醇結(jié)晶減少。詳見圖1。

圖1 各組小鼠升主動脈HE染色結(jié)果

2.2 各組小鼠升主動脈斑塊校正后斑塊面積比較 各給藥組與模型組相比，升主動脈斑塊校正后斑塊面積比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與養(yǎng)心氏片高劑量組相比，養(yǎng)心氏片低劑量組與養(yǎng)心氏片中劑量組升主動脈斑塊校正后斑塊面積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且升主動脈斑塊校正后斑塊面積隨養(yǎng)心氏片劑量水平的上升而逐漸下降，呈量效關(guān)系，而養(yǎng)心氏片高劑量組與陽性對照組升主動脈斑塊校正后斑塊面積相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.3 各組小鼠主動脈NF-κB信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平比較 與正常對照組小鼠相比，模型組及各給藥組小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。各給藥組小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平低于模型組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。養(yǎng)心氏片高劑量組小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平低于養(yǎng)心氏片低劑量組及養(yǎng)心氏片中劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性，即小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平隨養(yǎng)心氏片給藥劑量的增加而下降。養(yǎng)心氏片高劑量組小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表1 各組小鼠升主動脈斑塊校正后斑塊面積水平(±s) mm2

與模型組比較，1)P<0.05；與養(yǎng)心氏片高劑量組比較，2)P<0.05

表2 各組小鼠主動脈NF-κB信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平比較(±s)

1)與正常對照組比較，P<0.05；2)與模型組比較，P<0.05；3)與養(yǎng)心氏片高劑量組相比，P<0.05

3 討 論

AS的治療一直是研究的熱點，AS是一種由多種因素導(dǎo)致的慢性血管性炎癥性疾病，目前臨床上治療AS主要采用介入治療或降脂治療，介入治療風(fēng)險較大，而降脂藥長期服用易損傷肝功能，停藥后血脂水平極易反彈，甚至比未用降脂藥之前血脂水平更高，導(dǎo)致很多病人不能長期耐受。中醫(yī)診治具有辨證論治及整體治療的雙重特點，中藥毒副作用小，長期服用無明顯不適，耐受性強，其作用多靶點、多途徑，可根據(jù)病人的情況調(diào)整用藥，較西藥用藥更加靈活，可作為治療AS的一種長期有效的療法。

多項臨床試驗證明，養(yǎng)心氏片對冠心病具有良好療效，養(yǎng)心氏片源于著名老中醫(yī)周次清的臨床經(jīng)驗方，由人參、黃芪 、丹參、醋延胡索等13味藥物組成，具有益氣活血、化瘀止痛的功效。以“養(yǎng)心理論”為指導(dǎo)思想所創(chuàng)造的養(yǎng)心氏片，圍繞著“心主血、心主脈、心藏神”的生理功能，體現(xiàn)著養(yǎng)心氏片以補為養(yǎng)、以通為養(yǎng)、以安為養(yǎng)的學(xué)術(shù)思想，主治冠心病氣虛血瘀證。統(tǒng)計顯示：冠心病的13種中醫(yī)證型中氣虛血瘀證占13.85%，排名第三，而在腦梗死13種中醫(yī)證型中，氣虛血瘀證占19.42%，排名第二[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示：長春地區(qū)肥胖合并頸動脈粥樣硬化的四大主要證型之一是氣虛血瘀證[3]。由此可見AS常見證型是氣虛血瘀證。

近年來有大量的研究關(guān)于NF-κB活性抑制藥延緩AS病程的報道，故NF-κB信號通路在AS進程中起關(guān)鍵作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，從早期的脂質(zhì)氧化、內(nèi)皮細(xì)胞受損，到AS斑塊的形成，始終伴隨著炎癥反應(yīng)，而在AS形成中，參與炎癥反應(yīng)的很多重要炎癥因子都是 NF-κB 的靶基因，NF-κB信號通路調(diào)控了這些炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[5]。典型的NF-κB是由多肽鏈p50和p65亞基組成，當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB與抑制蛋白(IκB)結(jié)合形成三聚體，其在細(xì)胞質(zhì)中以無活性的形式存在[6]，當(dāng)細(xì)胞受到外界信號刺激時，IκB發(fā)生磷酸化并降解，此時NF-κB逃離IκB的控制而被激活，NF-κB進入細(xì)胞核內(nèi)并與靶基因相應(yīng)部位結(jié)合，開啟相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]。在 AS中，NF-κB 是黏附分子、趨化因子、細(xì)胞因子、炎癥因子以及生長因子的重要調(diào)控因子，可促進斑塊的形成與發(fā)展，最終導(dǎo)致斑塊破裂引起冠心病以及腦卒中等危重心血管疾病的發(fā)生[9-10]。NF-κB是一類具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄作用的因子，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生是通過激活多種細(xì)胞因子表達(dá)來實現(xiàn)，目前已知細(xì)胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[11]。TNF-α通過正負(fù)反饋激活NF-κB，引起炎癥持續(xù)發(fā)生導(dǎo)致AS。TNF-α以通過激活 NF-κB 信號途徑，促使大量的炎癥因子與黏附分子在內(nèi)皮細(xì)胞合成，這些因子可以激活或者募集各類炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，加速血管氧化、炎癥反應(yīng)及血栓形成[12]。VCAM-1是免疫球蛋白超家族的成員，在機體受到致炎因子如TNF-α、IL-6的刺激下，VCAM-1的表達(dá)會增加，參與淋巴細(xì)胞的活化與遷移，并在炎癥過程中起重要作用[13]。NF-κB可調(diào)控TNF-α、IL-6、VCAM-1、MCP-1的表達(dá)，一方面，TNF-α、IL-6可促進內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VCAM-1，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附至血管內(nèi)皮，衍變成為泡沫細(xì)胞，另一方面，TNF-α、IL-6促進巨噬細(xì)胞表達(dá)MCP-1，可趨化單核細(xì)胞遷移入動脈內(nèi)皮下層，然后巨噬細(xì)胞通過攝取氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)形成泡沫細(xì)胞，加速動脈粥樣斑塊的形成，更重要的是，TNF-α、IL-6可進一步活化NF-κB，促進TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1的表達(dá)，形成一個惡性循環(huán)，加劇AS的發(fā)展[4]。

本實驗結(jié)果證明，養(yǎng)心氏片可降低主動脈NF-κB信號通路下游相關(guān)因子TNF-α、IL-6、VCAM-1、MCP-1的表達(dá)。表明養(yǎng)心氏片可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路降低炎癥反應(yīng)，減少趨化單核細(xì)胞在受損血管內(nèi)皮處轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，減緩泡沫細(xì)胞的形成，發(fā)揮AS的作用，而養(yǎng)心氏片高劑量組對NF-κB信號通路相關(guān)因子的調(diào)節(jié)效果與阿托伐他汀無明顯差異。提示養(yǎng)心氏可有效改善AS，其機制可能與降低AS小鼠升主動脈斑塊校正后斑塊面積及下調(diào)主動脈NF-κB信號通路相關(guān)因子 mRNA的表達(dá)有關(guān)。