遲婷婷 滕銀燕 孫瑋明 林海霞 鄭磊 田新橋

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作為糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者嚴(yán)重且常見的并發(fā)癥之一，伴隨DM患者數(shù)量的增長而迅速增多，已成為DM患者發(fā)生心力衰竭的重要原因。因此，DCM的防治研究成為近些年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。有學(xué)者基于酸性成纖維細(xì)胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）特點(diǎn)[1-2]，構(gòu)建了aFGF的突變體，即改構(gòu)型酸性成纖維細(xì)胞生長因子（modified acidic fibroblast growth factor，MaFGF），經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MaFGF在改善心功能障礙方面極具前景[3-4]，但因其穩(wěn)定性差[5-6]，易失活，且目前缺乏高效的靶器官速遞技術(shù)，使藥效得不到充分發(fā)揮，限制其臨床應(yīng)用與開發(fā)。超聲靶向微泡擊破技術(shù)（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD） 恰是超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新興靶向傳輸技術(shù)，是利用超聲波空化效應(yīng)與聲孔效應(yīng)增加血管內(nèi)皮通透性，增加外源性物質(zhì)到達(dá)靶位的數(shù)量，從而發(fā)揮更強(qiáng)生物學(xué)作用，在心血管疾病防治方面發(fā)揮越來越大的價(jià)值[7-9]。因此，本研究擬應(yīng)用UTMD技術(shù)將MaFGF靶向遞送到DCM大鼠的左心室，再應(yīng)用超聲心動圖、速度向量成像（velocity vector imaging，VVI）及病理學(xué)檢查等多種方法評價(jià)其對DCM大鼠左心室收縮功能的改善價(jià)值。旨在為DCM的防治研究提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠75只，鼠齡 40～50d，體重（210±25）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號：SCXK（浙）2019-0001]；MaFGF凍干粉由溫州醫(yī)科大學(xué)生物與天然藥物開發(fā)中心有限公司提供；微泡對比劑采用SonoVue（Bracco公司，產(chǎn)品批號：18A022A）。實(shí)驗(yàn)采用Acuson Sequoia 512C彩色多普勒超聲診斷儀（Siemens公司），線陣探頭（15L8w-S），頻率12 ～14 MHz。TUNEL試劑盒購自羅氏公司（批號：11684817910），鏈脲佐菌素（STZ，批號：WXBC6558V）、天狼星紅染色試劑（批號：29384K）購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 制備MaFGF的超聲微泡混懸液 50μg MaFGF凍干粉與5ml 0.5%氯化鈉溶液混合，輕度振搖充分溶解后形成單純MaFGF溶液。再將5 ml單純MaFGF溶液注入SonoVue瓶中，形成MaFGF-SonoVue混懸液，臨用前持續(xù)振蕩搖勻。結(jié)合既往研究使用的MaFGFSonoVue混懸液中含MaFGF的濃度為10μg/ml[3]。

1.2.2 動物模型建立、分組和干預(yù) 75只大鼠在通風(fēng)恒溫的SPF級動物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周（室溫約20～24℃，平均濕度約50%～60%，人工控制開關(guān)模擬晝夜變化，飼養(yǎng)過程中無菌水自由供給），禁食不禁水12h。采用隨機(jī)數(shù)字表法挑選15只作為N組，不做干預(yù)，余60只經(jīng)腹腔一次性注射70mg/kg的STZ（使用前用pH為4.5的檸檬酸緩沖液稀釋為1%溶液）誘導(dǎo)建立DM模型，分別于注射后第1天、第3天、第7天尾靜脈取血測空腹血糖濃度，血糖濃度持續(xù)穩(wěn)定在16.7mmol/L以上，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象后，繼續(xù)高糖、高脂飲食飼養(yǎng)8周，研究發(fā)現(xiàn)DM大鼠8周后就出現(xiàn)心功能異常，即認(rèn)為形成DCM模型[10]。將造模成功52只大鼠（剔除8只造模未成功）采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為DCM 組 、MaFGF 組 、MaFGF-SonoVue 組 、MaFGFSonoVue+UTMD組，每組13只。

N組及DCM組不做干預(yù)處理，MaFGF組及MaFGFSonoVue組大鼠由10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3ml/kg）后分別經(jīng)尾靜脈一次性緩慢推注MaFGF溶液及（MaFGF-SonoVue）混懸液，1min內(nèi)完成注射。MaFGFSonoVue+UTMD組大鼠麻醉后，剃掉心前區(qū)鼠毛，將超聲儀探頭置于心前區(qū)皮膚，取乳頭肌水平左室短軸切面，聚焦深度為 3.5～4.0 cm，經(jīng)尾靜脈一次性緩慢推注MaFGF-SonoVue混懸液，1min內(nèi)完成，當(dāng)心肌內(nèi)見大量微泡充盈時(shí)即用機(jī)器自帶的MBD功能反復(fù)多次爆破微泡（機(jī)械指數(shù)MI=1.9），直至微泡完全消失。實(shí)驗(yàn)大鼠給藥劑量為15μg/kg。每周干預(yù)2次，連續(xù)4周。

1.2.3 圖像及數(shù)據(jù)采集 干預(yù)4周后，所有大鼠逐個(gè)稱重、記錄數(shù)據(jù)，麻醉后連接心電圖，行常規(guī)超聲心動圖檢查，測量各組大鼠的左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左心室短軸縮短率（LVFS）。隨后啟動VVI成像模式，于乳頭肌水平左心室短軸觀采集連續(xù)3個(gè)心動周期的二維灰階動態(tài)圖像，存入MO光盤，然后導(dǎo)入Siemens Sygno US Workplace 3.01分析軟件進(jìn)行分析，測定左心室6個(gè)室壁節(jié)段的收縮期平均峰值速度（Vs）、徑向應(yīng)變（Sr）及徑向應(yīng)變率（SRr）。

1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）檢測 處死大鼠，打開心包，剔出左心室，取乳頭肌水平左心室心肌，置于10%的甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋，連續(xù)約5μm切片，按照試劑盒指示進(jìn)行TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。每組取12張切片，每張切片隨機(jī)取20個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)該視野細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)，AI（%）=視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 血管周圍膠原面積與血管腔面積之比（PVCA/LA）檢測 取每組大鼠心肌組織切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行天狼星紅染色。封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨后應(yīng)用IPP6.0軟件分析計(jì)算PVCA/LA，每組取12張切片，每張切片隨機(jī)取20個(gè)400倍視野。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以表示，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊者采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，N組無死亡，DCM組死亡4只，MaFGF組及MaFGF-SonoVue組各死亡3只，MaFGF-SonoVue+UTMD組死亡2只。

2.2 各組大鼠常規(guī)超聲心動圖及VVI指標(biāo)比較 見表1。

表1 超聲心動圖比較及VVI指標(biāo)比較

由表1可見，干預(yù)4周后，DCM組LVIDd及LVIDs均較 N 組增加（均 P＜0.05），而 LVEF、LVFS、Vs、Sr及SRr卻明顯下降（均 P＜0.05）；MaFGF 組和 MaFGFSonoVue 組 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr較 DCM 組上升（均 P＜0.05），LVIDs 卻減低（均 P＜0.05），但兩組間無明顯差異；MaFGF-SonoVue+UTMD組LVIDd及LVIDs均較 DCM 組降低（均 P＜0.05），且 LVEF、LVFS、Vs、Sr、SRr較MaFGF組及MaFGF-SonoVue組均明顯升高（均 P＜0.05）。

2.3 病理學(xué)檢查結(jié)果 TUNEL染色示凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，干預(yù)4周后，N組心肌僅有極少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡（插頁圖1a）；DCM組細(xì)胞凋亡增多（插頁圖1b）；MaFGF組及MaFGF-SonoVue組凋亡細(xì)胞數(shù)目相近，但較DCM組減少（插頁圖1c、d）。MaFGFSonoVue+UTMD組凋亡細(xì)胞數(shù)較其他治療組減少（插頁圖 1e）。

天狼星紅染色顯示DCM組血管周圍纖維化情況較N組明顯增多（插頁圖2a、b），MaFGF組及 MaFGFSonoVue組均較DCM組略好轉(zhuǎn)（插頁圖2c、d）；MaFGFSonoVue+UTMD組較其他治療組好轉(zhuǎn)（插頁圖2e）。

2.4 各組大鼠AI及PVCA/LA比較 見表2。

表2 各組大鼠AI及PVCA/LA比較

由表2可見，DCM組AI及PVCA/LA均較N組明顯升高（均 P＜0.05）；MaFGF 組及 MaFGF-SonoVue組間AI及PVCA/LA均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但較DCM組均略下降 （均 P＜0.05）；MaFGF-SonoVue+UTMD 組 AI及PVCA/LA較其他治療組均明顯下降（均P＜0.05）。

3 討論

DCM的概念是Hamby于1974年首次提出[11]，是指獨(dú)立于DM基礎(chǔ)心肌組織發(fā)生結(jié)構(gòu)與功能的損傷，逐漸進(jìn)展將導(dǎo)致充血性心力衰竭、心律失常及心源性休克，已成為DM患者死亡的重要原因之一。目前DCM確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，但普遍認(rèn)可針對抗氧化應(yīng)激損傷、誘導(dǎo)心肌血管生成、改善心肌微循環(huán)狀態(tài)、抗心肌細(xì)胞凋亡及纖維化治療等是DCM防治的重要策略[12]。因此具有抗氧化損傷、擴(kuò)張血管、營養(yǎng)神經(jīng)及保護(hù)心臟等功能的aFGF成為具有治療DCM潛力的藥物，但aFGF同時(shí)兼具誘發(fā)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，限制其應(yīng)用，于是我們使用具有aFGF同等心臟保護(hù)作用的突變體，即MaFGF。研究發(fā)現(xiàn)，在冠心病大鼠模型心肌組織中注射MaFGF可顯著減少心肌細(xì)胞凋亡并改善心功能[5]，另有研究表明MaFGF可能通過抗氧化應(yīng)激來抑制DM誘導(dǎo)的心功能障礙[6]。然而MaFGF是一種穩(wěn)定性較差的生物大分子藥物，在體外極易失活，全身給藥不良反應(yīng)大，目前缺乏安全、速效、可控的靶向給藥手段，以至MaFGF無法得到開發(fā)與推廣。

UTMD恰是超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展較快的靶向遞藥技術(shù)，具有靶向性強(qiáng)、侵襲性低、免疫原性低、毒性低、組織特異性及可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)[13]。田新橋等[14]利用UTMD遞送aFGF有效改善DCM大鼠的左心室收縮功能。張明等[15-16]利用UTMD技術(shù)將分別包載bFGF、aFGF的納米粒靶向遞送到DM誘導(dǎo)的心肌組織中，結(jié)果明顯延緩DCM進(jìn)程，改善心臟功能，減輕心肌細(xì)胞纖維化和凋亡現(xiàn)象，提升心肌組織微血管密度?？梢奤TMD技術(shù)為MaFGF靶向治療DCM實(shí)驗(yàn)研究提供了一種全新的方法。

我們利用UTMD技術(shù)將MaFGF送達(dá)DCM大鼠心肌組織后及時(shí)爆破，觀察該靶向給藥系統(tǒng)下DCM大鼠的左心室收縮功能變化。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，?yīng)用常規(guī)超聲及VVI檢測發(fā)現(xiàn)：DCM組LVIDd及LVIDs均較N組增加，而LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr明顯減低，說明 DCM 大鼠左心室功能明顯受損；經(jīng)TUNEL染色及天狼星紅染色后顯示：AI及PVCA/LA較N組明顯增高，說明DCM組大鼠出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡及血管周圍纖維化現(xiàn)象。而經(jīng)過MaFGF及MaFGF-SonoVue治療后較DCM組 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr增高，LVIDs、AI及 PVCA/LA 降低，說明大鼠左心室收縮功能、細(xì)胞凋亡及間質(zhì)纖維化現(xiàn)象得到改善，但兩種方法療效沒有差異性。MaFGFSonoVue+UTMD 組大鼠 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr較其他治療組明顯增高，說明UTMD技術(shù)可提高藥物對左心室收縮功能療效，AI及PVCA/LA明顯降低，可見MaFGF保護(hù)心肌的機(jī)制可能是從抗細(xì)胞凋亡、抗間質(zhì)纖維化方面發(fā)揮作用?？傊?，UTMD靶向遞藥系統(tǒng)為DCM防治提供了一種全新的靶向輸藥手段，在臨床應(yīng)用上極具前景，MaFGF有望成為治療DCM的研究方向。

本研究尚存在一些不足，治療組之間LVIDd無明顯改善，可能是因?yàn)榻o藥時(shí)間短或者樣本數(shù)量較小，超聲微泡作為藥物或者基因的載體，載藥量較低，穩(wěn)定性較差，局部維持時(shí)間較短，有待進(jìn)一步優(yōu)化。