吳素方，梁麗麗，鄭淑蘭，劉新

作者單位：河南省胸科醫(yī)院結(jié)核科，河南 鄭州450003

泌尿系結(jié)核（urinary tuberculosis，UTB）是一種較嚴(yán)重的肺外結(jié)核類型，其發(fā)病率約占結(jié)核病的4%，在肺外結(jié)核病人中其發(fā)病率30%～40%［1］。UTB起病隱匿，臨床表現(xiàn)具有多樣性，可表現(xiàn)為呈腰部疼痛、午后低熱、尿急、尿頻、尿痛、乏力、排尿不適等，其臨床癥狀通常在疾病晚期出現(xiàn)，常導(dǎo)致診斷的延誤，進(jìn)而引起泌尿系統(tǒng)器官的損毀［2］，UTB的臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，突顯了早期快速診斷的重要性。目前，結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是細(xì)菌學(xué)檢查，但是由于UTB病人的尿液標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)需時(shí)長(zhǎng)，且陽性率低，不能滿足臨床早期快速診治的需要；傳統(tǒng)涂片鏡檢抗酸涂片假陽性率較高，結(jié)果往往不可靠。因此，迫切需要能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的新方法。利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（GeneXpert MTB/RIF，簡(jiǎn)稱Xpert）是一種全新的分子診斷技術(shù)，具有較高的診斷靈敏度［3-4］；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）具有快速簡(jiǎn)便、特異性高的特點(diǎn)［5-7］。近年來，使用兩種方法用于肺結(jié)核診斷的文獻(xiàn)報(bào)道很多，但少有聯(lián)合用于肺外結(jié)核診斷的比較研究。本文主要探討Xpert聯(lián)合T-SPOT對(duì)UTB診斷效能的評(píng)價(jià)，旨在為UTB早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月至2018年12月河南省胸科醫(yī)院就診，臨床疑似UTB病人89例。病人入組條件為具有尿急、尿頻、尿痛、排尿不適、血尿、腰痛、乏力等臨床癥狀或尿常規(guī)檢查異常病人。所有接受抗結(jié)核藥物治療不足1個(gè)月，未進(jìn)行泌尿系手術(shù)治療。所有病人HIV檢測(cè)陰性。

病人的人口學(xué)信息及臨床特征（如性別、年齡、病史、并發(fā)癥、泌尿系統(tǒng)器官累及的范圍及病變形式）等內(nèi)容均來源于臨床原始病史記錄，臨床資料完整。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 UTB病人的臨床診斷依據(jù)和排除標(biāo)準(zhǔn)BACTEC MGIT 960分支桿菌培養(yǎng)陽性；典型的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室尿常規(guī)檢測(cè)、結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）等相關(guān)檢查有陽性結(jié)果、泌尿系影像學(xué)表現(xiàn)、膀胱鏡活檢病理檢查有結(jié)核、抗結(jié)核藥物治療反應(yīng)良好。臨床診斷為非UTB的依據(jù)為：病人沒有結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、影像學(xué)、病理學(xué)等其他結(jié)核方面證據(jù)，并且抗結(jié)核藥物治療無效者。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 樣本采集 收集每例病例24 h尿沉渣標(biāo)本至少5 mL，每份標(biāo)本進(jìn)行涂片查抗酸桿菌、MGlT 960分枝桿菌培養(yǎng)和Xpert檢測(cè)。同時(shí)取病人靜脈血5mL，肝素抗凝，進(jìn)行T-SPOT檢測(cè)。

1.3.2 尿液標(biāo)本涂片查抗酸桿菌 一次性吸管吸取少許無菌標(biāo)本采集管中的尿液標(biāo)本涂于載玻片上進(jìn)行熒光染色（珠海貝索生物有限公司），置光學(xué)顯微鏡下（Olympus，日本）觀察計(jì)數(shù)，以每50個(gè)視野抗酸桿菌≥3條為陽性。

1.3.3 液體培養(yǎng) 取2 mL尿液標(biāo)本用于培養(yǎng)，使用MGIT 960分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)（BD，美國(guó)）按照操作說明書進(jìn)行。液體培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為42 d。儀器自動(dòng)報(bào)告陽性后，取培養(yǎng)液涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽性；若未見抗酸桿菌則為陰性。

1.3.4 Xpert檢測(cè) 取1 mL尿液標(biāo)本與標(biāo)配處理液常規(guī)按1∶2比例混合，旋緊管蓋，渦旋振蕩15-30 S，室溫靜置15 min，使標(biāo)本充分液化。吸取2 mL液化的標(biāo)本至Xpert反應(yīng)試劑盒，置于Xpert檢測(cè)系統(tǒng)（Cepheid，美國(guó)），儀器開始進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。約2 h反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下可直接觀察測(cè)試結(jié)果判讀檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果根據(jù)探針循環(huán)閾值（Ct值）判斷［5］。當(dāng)內(nèi)對(duì)照探針Ct值≤38視為陽性，對(duì)照探針Ct值＞38視為陰性；如果讀出結(jié)果顯示“invalid”“error”“no result”時(shí)，若樣本足夠時(shí)應(yīng)重復(fù)檢測(cè)一次。

1.3.5 T-SPOT試驗(yàn) 采集病人空腹靜脈血5 mL，肝素抗凝，加入淋巴細(xì)胞分離液離心，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，洗滌與計(jì)數(shù)后制備成工作濃度細(xì)胞懸液，將工作懸液和結(jié)核特異抗原加入預(yù)包被有干擾素-γ（IFN-γ）抗體反應(yīng)孔中，37 ℃、5%二氧化碳孵育過夜，洗滌微孔板加入酶標(biāo)抗體，洗滌微孔板加入底物反應(yīng)液，記錄斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)。結(jié)果判讀：當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)0-5，ESAT-6或CEP-10抗原孔斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照孔斑數(shù)點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)，則為陽性；當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)，孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)時(shí)，則為陰性。

1.3.6 靈敏度和特異度的計(jì)算 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)。靈敏度＝真陽性例數(shù)／（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度＝真陰性例數(shù)／（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%。

2 結(jié)果

2.1 一般情況和檢測(cè)結(jié)果 共計(jì)91例病例符合納入條件，其中2例為HIV感染者，最終進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的病例數(shù)為89例。其中42例（47.1%）病例臨床確診為UTB，UTB病人中分枝桿菌培養(yǎng)陽性18例（42.8%）；其余24例（57.1%）以典型臨床表現(xiàn)、泌尿系相關(guān)影像學(xué)表現(xiàn)、膀胱鏡活檢病理結(jié)果、及抗結(jié)核藥物治療有效等作為診斷依據(jù)。47例（52.8%）病例被臨床診斷為非泌尿系結(jié)核。見表1。

表1 臨床疑似UTB病人89例臨床檢測(cè)結(jié)果的比較/例（%）

UTB病例的臨床資料顯示，其病程較長(zhǎng)，一般1.5～3年，在各個(gè)年齡段均有發(fā)病，但以老年男性居多。病人通常合并有尿常規(guī)的異常比例升高，臨床表現(xiàn)更多地表現(xiàn)為尿頻、尿急、夜尿增多等儲(chǔ)尿期癥狀及腰痛明顯；同時(shí)伴有嚴(yán)重的腎臟破壞，更易并發(fā)腎盂積液，輸尿管增厚、狹窄或擴(kuò)張，膀胱攣縮等癥狀。與非UTB病人相比，病人同時(shí)合并有生殖系統(tǒng)結(jié)核及慢性腎臟疾病的比例升高。

2.2 Xpert聯(lián)合T-SPOT診斷UTB的靈敏度和特異度 以臨床診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，抗酸桿菌涂片、液體培養(yǎng)、Xpert和TSPOT以及Xpert+TSPOT聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異度，見表2。

表2 臨床疑似UTB病人89例5種檢測(cè)方法的靈敏度和特異度比較/例（%）

抗酸桿菌涂片的靈敏度為11.8%，顯著低于液體培養(yǎng)的靈敏度42.8%（χ2＝21.215，P＜0.001）。T-SPOT的特異性為74.4%，顯著低于抗酸桿菌涂片的特異度95.7%（χ2＝11.255，P＜0.01）。T-SPOT的靈敏度為 85.7%，顯著高于 Xpert的靈敏度（χ2＝15.321，P＜0.01）。

Xpert+T-SPOT聯(lián)合檢測(cè)的特異度為100%，靈敏度為89.4%，顯著高于抗酸涂片（χ2＝57.225，P＜0.001）、液體培養(yǎng)法（χ2＝19.112，P＜0.001）、Xpert檢 測(cè)（χ2＝7.823，P＜0.01）和 T-SPOT 檢 測(cè)（χ2＝2.573，P＜0.05）。

3 討論

UTB起病隱匿，泌尿系統(tǒng)的損傷呈漸進(jìn)性發(fā)展，早期臨床表現(xiàn)的缺乏和非特異性常導(dǎo)致診斷的延誤。這對(duì)臨床上UTB的診斷提出了挑戰(zhàn)。Xpert是世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的遏制結(jié)核病的檢測(cè)方法［8-9］，于2013年又推薦用于肺外結(jié)核的診斷［10］。近年來的多項(xiàng)研究表明，Xpert用于肺結(jié)核的診斷均有較高的靈敏度和特異性，但對(duì)肺外結(jié)核的診斷研究并不多。Bahr等［11］證實(shí)了應(yīng)用Xpert檢測(cè)腦脊液標(biāo)本診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度達(dá)72.0%（13/18），遠(yuǎn)高于腦脊液抗酸桿菌涂片靈敏度（27.8%，5/18；P＝0.008），與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)靈敏度相似71.2%（12/17），但培養(yǎng)法造成了27d的診斷延誤。王桂榮和黃海榮［12］應(yīng)用Xpert技術(shù)通過檢測(cè)骨關(guān)節(jié)結(jié)核部位的膿液標(biāo)本證實(shí)了此項(xiàng)技術(shù)快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的高靈敏度（82.0%，41/50）和高特異度（100.0%，10/10），并證實(shí)了Xpert檢測(cè)利福平耐藥的靈敏度和特異度均為100.0%。本研究中，Xpert檢測(cè)的靈敏度為64.2%，較低于以上研究結(jié)果，考慮可能與尿液結(jié)核菌含量較低、Xpert檢測(cè)方法檢測(cè)限值有關(guān)。

T-SPOT通過結(jié)核分枝桿菌特異性抗原多肽刺激T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，與微孔板IFN-γ抗體結(jié)合，通過顯色反應(yīng)后形成色素沉淀斑點(diǎn)，達(dá)到診斷結(jié)核感染的目的［13-14］，是一項(xiàng)檢測(cè)血清干擾素-γ（IFN-γ）、抗原特異T淋巴細(xì)胞極為敏感的技術(shù)，且不會(huì)受到T淋巴細(xì)胞數(shù)量、卡介苗和非結(jié)核桿菌的影響，即使在免疫功能低下的人群中，T-SPOT的靈敏度仍然較高［15-17］。本研究中血清T-SPOT檢測(cè)的靈敏度為85.7%（36/42），特異度為74.4（35/47），且在臨床診斷為UTB，而在涂片、培養(yǎng)及Xpert均為陰性的病人中T-SPOT的陽性率為81.3%（26/32）彌補(bǔ)了UTB病原學(xué)檢測(cè)靈敏度低的問題。本研究結(jié)果顯示T-SPOT在非UTB病人中的陽性率達(dá)到25.5%，顯著高于其他方法，究其原因是由于其對(duì)潛伏性結(jié)核感染的靈敏度較高，我國(guó)是結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家，人群中潛伏性結(jié)核感染率較高，這就是導(dǎo)致T-SPOT檢測(cè)特異度不高的原因。

在臨床診斷UTB病人中，Xpert聯(lián)合T-SPOT檢測(cè)的靈敏度為89.4%（38/42），特異度為100%（47/47），其靈敏度及特異度顯著大于抗酸涂片，液體培養(yǎng)，Xpert檢測(cè)以及T-SPOT檢測(cè)，兩者的聯(lián)合使用既彌補(bǔ)了Xpert的靈敏度不足也能夠彌補(bǔ)T-SPOT特異度不足的缺陷，且用時(shí)更短。UTB的早期臨床表現(xiàn)的隱匿性和不典型性，使其診斷較為困難，因此，盡早對(duì)可疑病人進(jìn)行Xpert聯(lián)合T-SPOT檢測(cè)，能及早發(fā)現(xiàn)結(jié)核病的診斷依據(jù)并進(jìn)行鑒別診斷，從而能夠選擇合適的抗結(jié)核治療方案治愈UTB病人，避免腎功能損害及后遺癥。此兩種方法的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于UTB的臨床診斷有著非常好的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得廣泛推廣應(yīng)用。但是由于此兩種方法的實(shí)驗(yàn)室條件要求較高，在基層醫(yī)院開展尚存在一定困難，因此簡(jiǎn)易便攜的實(shí)驗(yàn)儀器和試劑是重要的研發(fā)方向。

在檢測(cè)方法的比較研究中，病例的選擇、樣本的采集、檢測(cè)試劑的廠家以及操作人員等都是可能的影響因素，因此有必要開展更嚴(yán)謹(jǐn)、人群規(guī)模更大的研究。