劉云，楊玉忠

作者單位：新鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 新鄉(xiāng)453000

消化性潰瘍是臨床上常見的病癥，它的發(fā)作常伴有諸多的不適癥狀如噯氣、惡心、胃灼熱等，嚴(yán)重影響患者的生活［1］。幽門螺桿菌感染常常是消化性潰瘍的一個(gè)重要的誘導(dǎo)因素［2-3］。目前，不法分子將化學(xué)藥物非法加入中成藥及保健食品中的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生［4-5］，這些化學(xué)藥物的不當(dāng)應(yīng)用會(huì)造成嚴(yán)重的不良后果，給人們的生活造成嚴(yán)重的威脅［6］。而胃藥非法添加的檢測(cè)方法尚未健全［7-10］，本研究針對(duì)抗消化性潰瘍類中成藥及保健食品中非法添加的17種化學(xué)藥物（包括胃泌素受體阻斷藥丙谷胺，增強(qiáng)胃黏膜屏障功能的藥物米索前列醇，H2受體阻斷藥西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁，質(zhì)子泵抑制藥奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑、雷貝拉唑，M膽堿受體阻斷藥阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿、溴丙胺太林，抗幽門螺桿菌藥物阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑）研究建立了采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）進(jìn)行定性定量同步檢測(cè)的方法。以完善對(duì)此類藥物非法添加的檢測(cè)，有效應(yīng)對(duì)此類化學(xué)藥物非法添加的監(jiān)管要求。

1 儀器與試劑

LC-20A型超高效液相色譜儀（日本島津公司）串聯(lián)API3200型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；Shim-pack XR-ODSⅡ型色譜柱（日本島津公司，2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；W-濾膜0.22 μm（天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司），VGT-2120QTD型超聲清洗儀（廣東固特超聲股份有限公司）；BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

對(duì)照品丙谷胺、米索前列醇、西咪替丁、鹽酸雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁、奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑鈉、雷貝拉唑鈉、硫酸阿托品、消旋山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿、溴丙胺太林、甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林批號(hào)分別為100176-201104、410004-201502、100158-201406、100163-201607、100305-201304、100853-201502、100367-201706、100709-201304、100575-201505、100658-201705、100040-201312、100249-201303、100049-201310、100471-201402、100191-201507、130558-201303、130409-201512，含量分別為99.7%、99.8%、98.9%、99.9%、99.5%、99.6%、100.0%、99.8%、95.8%、99.7%、97.2%、99.8%、99.6%、98.6%、100.0%、97.2%、86.9%，以上17種對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。實(shí)測(cè)樣品來(lái)自于市場(chǎng)抽檢。乙腈、甲酸和乙酸銨均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher試劑公司。水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 島津Shim-pack XR-ODSⅡ（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）色譜柱，柱溫20℃，流速0.25 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。ESI正離子掃描模式（ESI+）流動(dòng)相系統(tǒng)：以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸水溶液（含7 mmol/L的乙酸銨）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～8 min，90%～70%B；8～10 min，70%～60%B；10～13 min，60%～90%B；13～15 min，90%B），采集時(shí)間15 min；ESI負(fù)離子掃描模式（ESI-）流動(dòng)相：乙腈-15 mmol/L乙酸銨（50：50），采集時(shí)間5 min。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子化源（ESI），正、負(fù)離子掃描模式；離子噴射電壓（IS）：5 000 V；離子源溫度（TEM）：500℃；源內(nèi)氣體GS1（Nebulizer gas，N2）：25 psi；輔助加熱氣GS2（Heated gas，N2）：45 psi；氣簾氣體（Cur Gas）：35 psi。監(jiān)測(cè)方式MRM。17種物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子峰、主要離子碎片峰及其質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集參數(shù)見表1。

表1 17種抗?jié)儾∷幍馁|(zhì)譜采集參數(shù)

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 ESI+模式對(duì)照品溶液的制備：精密稱取阿莫西林、西咪替丁、法莫替丁、甲硝唑、山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品、雷貝拉唑、奧美拉唑、泮托拉唑、克拉霉素、蘭索拉唑、溴丙胺太林、丙谷胺對(duì)照品各約10 mg，分別置于20 mL棕色量瓶用50%乙腈水溶液配制成對(duì)照品儲(chǔ)備液，冷藏。根據(jù)離子化效率的不同，精密量取溴丙胺太林儲(chǔ)備液0.04 mL，硫酸阿托品、奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑鈉、克拉霉素儲(chǔ)備液各0.1 mL，氫溴酸東莨菪堿、消旋山莨菪堿、雷貝拉唑鈉儲(chǔ)備液各0.2 mL，西咪替丁、丙谷胺儲(chǔ)備液各0.3 mL，甲硝唑儲(chǔ)備液0.8 mL，法莫替丁、阿莫西林儲(chǔ)備液各3 mL置于同一25 mL棕色量瓶中，用50%乙腈配置成ESI+混合對(duì)照品中間儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品中間儲(chǔ)備液2 mL置50 mL量瓶中，用10%乙腈水溶液定容，搖勻，濾過(guò)（文中所述“濾過(guò)”均為用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)）。

ESI-模式對(duì)照品溶液的制備：精密稱取雷尼替丁、尼扎替丁、米索前列醇對(duì)照品約10 mg，分別置于20 mL棕色量瓶用50%乙腈水溶液配置成對(duì)照品儲(chǔ)備液，冷藏。精密量取米索前列醇對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，鹽酸雷尼替丁、尼扎替丁儲(chǔ)備液各1 mL置于同一25 mL棕色量瓶中，用50%乙腈配置成ESI-混合對(duì)照品中間儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品中間儲(chǔ)備液2 mL置50 mL量瓶中，用10%乙腈水溶液定容，搖勻，濾過(guò)。

2.3.2 供試品溶液的制備 取待測(cè)樣品1次服用劑量分別置于研缽中，研磨均勻成粉末狀，置于50 mL量瓶中，加50%乙腈40 mL，冰浴中超聲處理10 min，用50%乙腈定容，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液1 mL至100 mL量瓶中，用10%乙腈定容，搖勻；再精密量取1 mL至10 mL量瓶中，用10%乙腈定容，搖勻，濾過(guò)。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取待測(cè)樣品的陰性樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制成空白基質(zhì)粉末，分別取1次服用劑量，置于50 mL量瓶中，同法制備陰性對(duì)照溶液。

2.4 定性分析 取對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，將所得圖譜中各成分定性離子對(duì)之間的相對(duì)離子豐度和色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［11-13］。各化學(xué)藥定量離子對(duì)的MRM色譜圖見圖1，由圖1可知，保留時(shí)間相近的上述各化學(xué)藥在MRM采集模式下均能達(dá)到完全分離。

取供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄所得質(zhì)譜MRM色譜圖（圖2），根據(jù)所得液相質(zhì)譜圖，以定性離子對(duì)之間的相對(duì)豐度和保留時(shí)間定性［12］，結(jié)果表明，供試品中含有西咪替丁和丙谷胺。

取“2.3.3”項(xiàng)下的陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定，得到陰性對(duì)照溶液的TIC和MRM色譜圖，均未見有干擾17種目標(biāo)化學(xué)藥成分的色譜峰。

2.5 定量分析 對(duì)判定供試品溶液中含有的化學(xué)藥物，根據(jù)相應(yīng)對(duì)照品定量離子對(duì)和陽(yáng)性化學(xué)藥物定量離子對(duì)的峰面積之比等于對(duì)照品濃度與陽(yáng)性化學(xué)藥物的濃度之比的關(guān)系進(jìn)行含量計(jì)算［14］。

2.5.1 線性考察與檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）試驗(yàn) 取ESI+和ESI-兩種測(cè)定模式下的混合對(duì)照品中間儲(chǔ)備液各0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別用10%乙腈稀釋至50 mL，進(jìn)樣測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子對(duì)色譜峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得17種化學(xué)藥的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，17種化學(xué)藥均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于或等于0.995 1。

取混合對(duì)照品溶液適量，適當(dāng)稀釋，添加到陰性樣品中，制成質(zhì)量濃度約為0.5 mg/g的供試品，進(jìn)樣，以信噪比為3時(shí)各化學(xué)藥的LOD和信噪比為10時(shí)的LOQ的計(jì)算結(jié)果見表2，表明方法的靈敏度完全能滿足非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)要求。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液1份，連續(xù)進(jìn)樣6次，得17種化學(xué)藥物的定量離子對(duì)質(zhì)譜峰面積的RSD，其值均在0.9%～2.8%范圍內(nèi)，見表2。說(shuō)明該方法的精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取陰性樣品加入適量混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，混勻，取此樣品6份，按供試品的制備方法制備并測(cè)定，計(jì)算各成分含量的RSD值均在0.8%～3.0%，見表2。表明重復(fù)性較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.5.3項(xiàng)下的同一供試品溶液，分別于制備0、2、4、6、8 h后依法測(cè)定，根據(jù)上述17種化學(xué)藥的定量離子對(duì)峰面積計(jì)算RSD均在1.0%～4.6%，見表2，說(shuō)明供試品溶液在測(cè)定條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 取一次服用量的陰性樣品6份，分別置50 mL量瓶中，各加相應(yīng)的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，混勻，按供試品的制備方法制備，測(cè)定。17種化學(xué)藥的平均回收率見表2。從表中可以看出，各化學(xué)藥的標(biāo)準(zhǔn)加樣回收率均在81.5%～102.7%。

2.5.6 樣品測(cè)定 本研究收集相關(guān)中成藥及保健食品共10個(gè)樣品，取各樣品按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)測(cè)定，在10個(gè)樣品中檢出2個(gè)樣品添加了抗消化性潰瘍類化學(xué)藥物，分別為西咪替丁和丙谷胺，MRM色譜圖見圖2。根據(jù)定量離子對(duì)的色譜峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中添加的化學(xué)藥的量，樣品中檢出西咪替丁21.4 mg/g，丙谷胺18.1 mg/g。

圖1 17種抗?jié)儾∷帉?duì)照品定量離子對(duì)應(yīng)的MRM色譜圖：A為ESI+掃描模式，B為ESI-掃描模式

圖2 樣品溶液中西咪替丁、丙谷胺的定性、定量離子對(duì)MRM色譜圖

3 討論

本研究分別考察了以水、不同濃度的甲酸、乙酸、乙酸銨為水相，以甲醇、乙腈為有機(jī)相，將水相和有機(jī)相組成的各種組合為流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESI+模式下，乙腈-0.1%甲酸（含7 mmol/L乙酸銨）流動(dòng)相體系梯度洗脫，14種化合物的峰形和分離情況最好；ESI-模式下，以乙腈-15 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相等度洗脫，3種化合物峰形和分離情況最好。在質(zhì)譜條件優(yōu)化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)米索前列醇在負(fù)離子模式下靈敏度高，噪聲小，而其它16種化合物正離子模式靈敏度高，但是雷尼替丁和尼扎替丁在質(zhì)譜ESI+模式和液相相應(yīng)的流動(dòng)相下，峰形很差，基線高，峰底寬度超過(guò)3 min，不利于進(jìn)行定量定性，而這兩種化合物在ESI-模式下，雖然靈敏度相對(duì)于ESI+稍低，但在相應(yīng)的流動(dòng)相下，基線和峰形好，適用于定量和定性，故選擇ESI-模式檢測(cè)米索前列醇、雷尼替丁和尼扎替丁，用ESI+模式檢測(cè)其它14種化合物。

因質(zhì)子泵抑制藥不耐酸，因此口服質(zhì)子泵抑制劑藥大多為腸溶包衣制劑，以避免藥物因胃酸作用而造成生物利用度降低［15］；米索前列醇的純品化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，需存放于-20℃環(huán)境中，且在酸性和堿性條件下都能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而它卻可以在常溫下穩(wěn)定的保存于羥丙基甲基纖維素的分散體系中［16］，故米索前列醇被分散于此介質(zhì)中制成藥劑使用?；谏鲜鲈?，將質(zhì)子泵抑制藥和米索前列醇的原料藥作為非法添加物可能性很小，但是在日常檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，不法分子將化學(xué)制劑成品甚至過(guò)期藥添加入中成藥和保健品中的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因而不排除質(zhì)子泵抑制劑和米索前列醇以穩(wěn)定形式被非法添加的可能性。

表2 17種抗?jié)儾∷幍木€性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率及檢出限、定量限