張磊，蔡曉瑤，張莉，向曉輝，徐學君

作者單位：1武警特色醫(yī)學中心，a藥劑科，b肝膽胰脾中心，天津300162；2武警第一機動總隊，河北 石家莊050800；3武警后勤學院，天津300162；4武警安徽總隊醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥230000

蟾皮提取物是中華大蟾蜍的干燥表皮經(jīng)過煎煮得到的產(chǎn)物，其內(nèi)含有華蟾酥毒基（Cinobufagin，CBG）、酯蟾毒配基（Resibufogenin，RBG）等多種脂溶性成分，具有抗癌、強心利尿、麻醉、提高機體免疫力等功效［1-2］。其臨床應用注射液劑型存在局部刺激性和治療窗窄等副作用［3-4］。因此前期將蟾皮提取物［5］制成固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）［6］，所得 SLN 表現(xiàn)出良好的緩釋作用［7］。但固體脂質(zhì)納米粒的混懸液在長期存儲過程中易發(fā)生聚集、沉淀、水解以及磷脂氧化等現(xiàn)象。文獻表明真空冷凍干燥、噴霧干燥、超臨界流體技術［8-10］等都可以提高SLN的穩(wěn)定性。因此，本試驗采用真空冷凍干燥法制備凍干蟾皮提取物SLN，通過正交試驗等方法優(yōu)化凍干保護劑及工藝，并以蟾皮提取物中有效成分CBG、RBG的包封率為指標，評價凍干工藝對SLN穩(wěn)定性的影響。本研究起止時間為2011年4月至2017年12月。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗儀器 LC-20AT液相色譜儀（LC-20AT二元泵，SPD-20A型紫外檢測器，CTO-10AS型柱溫箱，日本shimadzu公司）；AT250分析天平（1/100000，瑞士METTLER TOLEDO公司）；JY92-2D型超聲波細胞破碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；EYELA冷凍干燥機（FDU-1200，東京理化公司）。

1.1.2 試驗試劑 華蟾酥毒基對照品（CBG，中國藥品生物制品檢定所，110803-200504）；酯蟾毒配基對照品（RBG，中國藥品生物制品檢定所，110718-200507）；蟾皮（批號090310）購自安徽亳州千草藥業(yè)飲片廠，蟾皮提取物浸膏（自制，含CBG和RBG分別為：1.824 mg/g和1.347 mg/g）；注射用卵磷脂（批號201403012，上海太偉藥業(yè)有限公司）；山崳酸甘油酯（上?？房倒荆患状迹ㄉV純，批號20150603，天津市康科德科技有限公司）；乙腈（色譜純，批號20140311，天津市康科德科技有限公司）；甘露醇（批號20150812北京奧博星生物科技責任技術有限公司），蔗糖（批號20150923，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠），乳糖（批號20150412，天津市化學試劑一廠），葡萄糖（批號20151001，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠）。

1.2 蟾皮提取物SLN包封率測定方法的建立

1.2.1 色譜條件的確立 色譜柱為ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-三氟乙酸（60∶40∶0.1），柱溫為50 ℃，流速為0.5 mL/min，檢測波長296 nm，進樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取CBG、RBG標準品86 mg和78 mg，甲醇定容至100 mL，制得濃度分別為860.00和780.00 μg/mL，而后精密吸取1 mL至10 mL量瓶，甲醇定容制得濃度分別為86.00和78.00 μg/mL的CBG、RBG對照品溶液。

1.2.3 標準曲線 分別精密吸取50、100、150、200、250、300 μL對照品溶液，置于10 mL量瓶，用甲醇定容，濃度為0.43、0.86、1.29、1.72、2.15、2.58 μg/mL，按照“1.2.2”項下色譜條件測定CBG與RBG峰面積，分別繪制標準曲線并做線性回歸。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液200 μL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，得CBG和RBG的質(zhì)量濃度分別為1.72 μg/mL和1.56 μg/mL的溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，計算CBG和RBG峰面積的RSD值。

1.2.5 精密度試驗 吸取“1.2.5”項下CBG、RBG濃度為1.72 μg/mL和1.56 μg/mL的溶液一天內(nèi)連續(xù)進樣6次，計算CBG和RBG峰面積的RSD值；另將上述混合對照品溶液，室溫避光保存，隔天進樣，連續(xù)6 d，計算CBG和RBG峰面積的RSD值。

1.2.6 蟾皮提取物SLN的制備 參照前期試驗文獻［11］方法：精密稱取300 mg卵磷脂、100 mg山崳酸甘油酯、300 mg浸膏溶于10 mL乙醇中，加熱至80℃溶解形成油相；同時將42 mL 5%P188以及8 mL 0.5%Tween 80水溶液加熱至同溫度，將油相緩慢滴入其中，100 r/min高速攪拌乳化150 min。隨即用400 W探頭超聲分散4 min（間歇10 s、持續(xù)20 s），冰浴攪拌15 min，用超純水定容至60 mL，得到淡黃色SLN混懸液。

1.2.7 蟾皮提取物SLN包封率的測定 取“1.2.1”項下制備的蟾皮提取物SLN混懸液5 mL，放入透析袋中，而后置于100 mL的PH 7.8的PBS溶液中，室溫下1 000 r/min攪拌透析液，于4 h吸取1 mL透析液進行HPLC分析，測得透析液中CBG濃度為c1，RBG濃度為c2，CBG包封率（EE%）＝（投藥量CBG-c1×100）/投藥量CBG×100%，RBG包封率（EE%）＝（投藥量RBG-c2×100）/投藥量RBG×100%。

1.3 凍干工藝的考察

1.3.1 預凍時間、溫度的考察 取已制備好的蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，加入600 mg甘露醇，混勻后于-40℃條件下，以外觀、復溶時間、顆粒形態(tài)為指標，考察預凍時間分別為4、6、8、12、24 h對凍干SLN的影響；另取已制備好蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，加入600 mg甘露醇，混勻后考察在-20℃、-40℃、-60℃［12］下預凍8 h對凍干SLN的影響。

1.3.2 升華干燥時間的考察 本試驗設定升華干燥溫度-45℃，取已制備好的蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，加入600 mg甘露醇，-40℃下預凍8 h后，考察升華干燥12、16、20、24 h對凍干SLN的影響。

1.3.3 解析干燥時間的考察 本試驗設定解析干燥溫度20℃，取已制備好的蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，600 mg甘露醇，-40℃下預凍8 h、-45℃下升華干燥20 h后，考察解析干燥3、4、5、6 h對凍干SLN的影響。

1.4 凍干保護劑的考察

1.4.1 凍干保護劑種類的考察 取已制備好的蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，分別加入600 mg（與磷脂質(zhì)量比為2∶1）的甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖，考察其對SLN的保護作用。

1.4.2 正交試驗設計優(yōu)選保護劑處方 為了達到最佳保護效果，將表現(xiàn)較好的甘露醇、乳糖、蔗糖三種混合用作保護劑。做正交設計，采用L9（34）正交表，以乳糖、甘露醇、蔗糖與磷脂（300 mg）質(zhì)量比作為考察因素，每個因素設1.5∶1，2∶1，4∶1三水平，實驗安排見表1。將外觀、復溶性、顆粒形態(tài)作為考察指標，每個指標采用百分制，具體標準如下：外觀＝體積（≤40）+質(zhì)地（≤30）+色澤（≤30），體積飽滿30～40分、略皺縮20～30分、皺縮10～20分、塌陷0～10分，質(zhì)地疏松20～30分、略致密10～20分、致密0～10分，色澤均勻20～30分、分層不明顯10～20分、分層明顯0～10分，外觀得分為三項分數(shù)相加；復溶性得分＝100-顆粒溶解時間（s），大于100 s記為零分；顆粒形態(tài)得分：顆粒不聚集70～100分、略聚集40～70分、聚集10～40分、聚集嚴重有結晶0～10分。

表1 乳糖、甘露醇、蔗糖質(zhì)量比的因素水平安排

1.5 凍干蟾皮提取物SLN質(zhì)量評價 室溫下，取優(yōu)化后的凍干蟾皮提取物SLN，60 mL生理鹽水復溶后，采用“1.2.7”項方法測定CBG與RBG的包封率；取適量制備的蟾皮提取物凍干SLN于激光散射儀中，測定SLN的大小及粒徑分布，用透射電鏡觀察形態(tài)。

1.6 凍干工藝對蟾皮提取物SLN穩(wěn)定性的影響分別取蟾皮提取物SLN混懸液和凍干蟾皮提取物SLN，在4 ℃、避光條件下放置，于第0、1、5、10、20、30天后取樣，測定并比較兩者包封率。

2 結果

2.1 包封率測定方法的建立 在所建立的色譜條件下，SLN中的輔料對藥物的檢測無干擾，CBG、RBG與其他成分的峰分離度均大1.5，分離較好，檢測限（LOD）為0.032 μg/mL，定量限（LOQ）為0.098 μg/mL，如圖1。

標準曲線方程：CBG：Y＝32 019X-3 169.3（r＝0.9992），RBG：Y＝39 789X-2 753.9（r＝0.999 9），表明CBG和RBG在0.43～2.58μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好；穩(wěn)定性試驗結果顯示CBG和RBG峰面積的RSD值分別為0.52%和0.65%，表明待測樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定；日內(nèi)、日間精密度試驗結果顯示CBG和RBG峰面積的RSD分別為0.82%和0.90%、1.11%和0.81%。表明日內(nèi)、日間精密度良好。以上結果表明該色譜方法可準確檢測CBG與RBG，利用此方法測得CBG的包封率為（91.01±0.75）%，RBG的包封率為（89.91±0.54）%。

2.2 凍干工藝的優(yōu)化 預凍溫度考察結果：預凍溫度為-20℃時，樣品未完全凍實，有噴瓶的現(xiàn)象發(fā)生，-40℃與-60℃均可得到外觀飽滿的凍干SLN，故選擇-40℃作為預凍溫度；預凍時間考察結果：4 h、6 h的樣品存在噴瓶、破損、外觀不平整的現(xiàn)象，8 h、12 h的樣品飽滿，疏松，色澤均勻，24 h樣品出現(xiàn)皺縮，故選擇8 h作為預凍時間；升華干燥時間考察結果：當時間小于20 h，樣品未完全干燥，室溫下放置后內(nèi)部融化，使樣品產(chǎn)生空腔，當干燥時間大于20 h，所得凍干SLN飽滿，疏松，色澤均勻、復溶性無明顯差異，因此選擇20 h作為升華干燥時間；解析干燥時間考察結果：解析干燥3 h的凍干SLN有水分殘留，室溫放置后內(nèi)部融化，解析干燥4、5、6 h所得凍干SLN外觀良好，因此選擇4 h作為解析干燥時間。

2.3 凍干保護劑的選擇 凍干保護劑種類考察的結果：使用單一的凍干保護劑會分別出現(xiàn)凍干產(chǎn)品表面塌陷、色澤不均、顆粒聚集、復溶時間過長等現(xiàn)象，因此本實驗將甘露醇、蔗糖、乳糖三者混合用做保護劑，以達到理想的凍干效果；正交試驗優(yōu)化凍干保護劑組成結果見表2，比較各因素的極差可知RB最大，故因素B對實驗結果影響最大，其次是C和A。由各個因素不同水平的綜合平均值k1、k2、k3可知，A1、B2、C1水平最優(yōu)，因此最優(yōu)處方為乳糖：甘露醇∶蔗糖∶磷脂（300 mg）＝1.5∶2∶1.5∶1。

表2 甘露醇、蔗糖、乳糖三者混合用做保護劑的正交試驗結果（n＝3）

圖1 華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的HPLC圖：A為混合對照品；B為蟾皮提取物固體脂質(zhì)納米粒；C為空白固體脂質(zhì)納米粒

2.4 蟾皮提取物凍干SLN的質(zhì)量評價 經(jīng)過試驗考察，確定乳糖：甘露醇：蔗糖：磷脂（300 mg）＝1.5∶2∶1.5∶1作為保護劑，-40℃下預凍8 h，-45℃下升華干燥20 h、25℃下解析干燥4h，得到蟾皮提取物凍干SLN。蟾皮提取物凍干SLN復溶樣品的CBG包封率為（88.96±1.50）%、RBG包封率為（89.65±0.78）%；激光散射儀中，測得SLN的大小及粒徑分布結果：樣品的平均粒徑（152±6.1）nm，90%粒徑小于（209.1±28.9）nm，多分散性指數(shù)為0.153±0.023，用透射電鏡觀察形態(tài)，見圖2。

圖2 蟾皮提取物脂質(zhì)納米粒透射電鏡圖（×50 000）

2.5 凍干工藝對SLN穩(wěn)定性的影響 蟾皮提取物SLN放置第0、1、5、10、20、30 d后測得CBG的包封率分別為 91.1%、88.2%、84.8%、79.6%、73.5%、68.1%，RBG的包封率分別為90.2%、87.4%、82.5%、75.3%、70.1%、65.9%；凍干蟾皮提取物SLN放置第0、1、5、10、20、30 d后復溶測得CBG的包封率分別為89.5%、87.3%、88.1%、87.9%、89.9%、88.7%，RBG的包封率分別為 89.9%、88.4%、86.8%、87.4%、87.2%、88.6%。結果表明：長期貯存會導致SLN中有效成分CBG、RBG包封率降低，凍干工藝可顯著提高蟾皮提取物SLN的穩(wěn)定性。

3 討論

理想的凍干產(chǎn)品應具有外形飽滿、色澤均勻、表面平整、復溶時間短等性質(zhì)，凍干保護劑、預凍溫度和時間、干燥時間都對凍干產(chǎn)品的性質(zhì)產(chǎn)生了重要的影響。在SLN混懸液中，氫鍵作用可使固體脂質(zhì)納米粒的脂質(zhì)雙分子層外部包裹著一層水化膜，可防止SLN發(fā)生聚集融合，提高穩(wěn)定性。但凍干過程會破壞SLN外部的水化層，使膜穩(wěn)定性降低，發(fā)生聚集、破裂［13］。加入凍干保護劑可在冷凍干燥過程代替水分子與SLN形成氫鍵，提高脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)定性［14］。在篩選保護劑種類時發(fā)現(xiàn)應用一種保護劑效果并不理想，因此采用混合保護劑。通過比較確定了甘露醇、乳糖、蔗糖三種保護劑，采用正交試驗，以外觀、復溶時間、顆粒形態(tài)為指標，篩選出復合凍干保護劑，對SLN表現(xiàn)出較好的保護作用，克服了單種保護劑出現(xiàn)的外觀塌陷，顆粒聚集等問題。

預凍過程需將樣品中的水全部凍實，實驗中發(fā)現(xiàn)預凍時間短、預凍溫度高均會使升華干燥時出現(xiàn)噴瓶的現(xiàn)象，而預凍時間過長會導致實驗儀器浪費。因此通過考察最終確定-40℃下冷凍8 h的方式。干燥過程分為升華干燥和解析干燥。升華干燥的過程是通過減壓降溫的方式將樣品中凍結的自由水以固態(tài)形式升華除去［15］，解析干燥則需要適當升高溫度來去除樣品中的結晶水。實驗發(fā)現(xiàn)若升華干燥時間短、水分去除不完全，會導致凍干產(chǎn)品出箱后內(nèi)部出現(xiàn)空洞、碎塊。因此本試驗通過單因素考察升華干燥、解析干燥對凍干產(chǎn)品的影響，確定了-45℃下升華干燥20 h、25℃下解析干燥4 h的干燥方式。

包封率是評價SLN穩(wěn)定性的重要指標［16-17］，長期存放會導致磷脂氧化變性，脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)定性下降，最終使藥物泄露。因此本試驗采用透析法測定貯存不同時間后SLN混懸液與凍干SLN的包封率。結果顯示未凍干SLN包封率明顯降低，SLN出現(xiàn)泄漏，而凍干后的SLN包封率未見明顯降低。該結果表明冷凍干燥是提高蟾皮提取物SLN的物理化學穩(wěn)定性的可行辦法，解決了蟾皮提取物SLN混懸液不穩(wěn)定的關鍵難題。