劉瑩，張濤，程麗華，邊青巖，石興亞，左玉柱，路廣計(jì)，范京惠

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院； 2.河北省動物疫病預(yù)防控制中心；3. 河北省饒陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局；4.石家莊市動物疫病預(yù)防控制中心）

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專欄

布魯氏菌病和結(jié)核?。ㄒ韵潞喎Q“兩病”）是危害奶牛健康的主要傳染病之一， 已被世界衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動物疫病，在我國被列為二類動物疫病， 并且一直受到密切關(guān)注。 布病的主要傳播途徑有消化道、呼吸道、皮膚黏膜以及生殖系統(tǒng)傳播， 其受侵害最為嚴(yán)重的是生殖系統(tǒng)， 嚴(yán)重影響生殖功能。 不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也危害人類的健康。牛結(jié)核病在我國《動物防疫法》中被列為二類動物疫病， 開放性結(jié)核病牛是傳染源的主要組成部分， 呼吸道和消化道為主要傳播途徑， 由于我國奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步擴(kuò)大且散養(yǎng)較多， 導(dǎo)致我國奶牛跨區(qū)域交易日益頻繁，不能得到有效地控制，致使我國畜牧養(yǎng)殖遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至危害人類健康， 威脅人類公共衛(wèi)生安全。

隨著畜牧養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，奶牛養(yǎng)殖數(shù)量不斷增加， 社會公共衛(wèi)生問題日趨嚴(yán)重。因此，本研究主要對石家莊市欒城區(qū)奶牛場2019 年牛布魯氏菌病和牛結(jié)核病的發(fā)病情況進(jìn)行監(jiān)測， 通過不同的檢測方法對“兩病”進(jìn)行監(jiān)測并對監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及分析，加強(qiáng)奶?！皟刹　钡钠詹?、監(jiān)測和防疫工作，對控制“兩病”的擴(kuò)散、保證養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益及人類生命健康安全有著至關(guān)重要的作用。

1 材料與方法

1.1 受檢奶牛

2019 年石家莊市欒城區(qū)某奶牛場存欄奶牛，共計(jì)檢測315 頭。

1.2 主要試劑

虎 紅 平 板 凝 聚 （ 批 號：01001190）購自青島立見公司；牛型結(jié)核菌素（批號：1824718）、禽型結(jié)核菌素 （批號：1804896）、 牛結(jié)核IFN-γ- ELISA 檢測試劑盒均購自青島瑞爾公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 布魯氏菌病按 照（GB/T18646-2002）國 家《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》進(jìn)行操作及判定。首先進(jìn)行血清學(xué)鑒定，將采集的牛血清用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初次篩選， 陽性者再用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行第二次檢測， 統(tǒng)計(jì)并分析監(jiān)測數(shù)據(jù)。

1.3.2 牛結(jié)核病

按 照（GB/T18646-2002）國 家《奶牛結(jié)核病診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行及判定。 同時(shí)采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（TST）、 比 較 皮 內(nèi) 變 態(tài) 反 應(yīng) 試 驗(yàn)（SICTT）和γ-干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （IFN-γ-ELISA）對314 頭奶牛進(jìn)行檢測。

1.3.2.1 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（TST）

首先，將待測奶牛頸中部上1/3處的毛剃掉， 直徑約10 厘米大小，用游標(biāo)卡尺測量奶牛原皮厚度并記錄。

其次，在注射結(jié)核菌素之前，先使用75%的酒精對即將注射部位進(jìn)行消毒， 用無菌注射器采用皮內(nèi)注射的方法單獨(dú)注射牛型結(jié)核菌素（BPPD） 和禽型結(jié)核菌素（APPD），出現(xiàn)豆大凸起即為注射成功。

最后， 再對牛注射BPPD 和APPD 72 小時(shí)之后觀察注射部位是否有明顯的紅腫現(xiàn)象， 使用游標(biāo)卡尺對注射部位中央皮皺厚度進(jìn)行測量并記錄， 根據(jù)判定方法及皮厚差的計(jì)算確定奶牛結(jié)核病的陰陽性。

1.3.2.2 比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（SICTT）

與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)類似，在奶牛頸中上部同側(cè)或兩側(cè)同時(shí)注射牛型結(jié)核菌素（BPPD）和禽型結(jié)核菌素（APPD），分別記錄注射前奶牛原皮厚度及注射72 小時(shí)之后中央皮皺厚度計(jì)算皮厚差進(jìn)行判定。

1.3.2.3 牛全血培養(yǎng)

用肝素鈉抗凝管采集至少5 毫升牛全血， 顛倒混勻后使肝素鈉完全溶解，并在8 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。將采集的全血分裝在24 孔板中，每份血樣分裝在三個(gè)孔中， 每孔1.5 毫升的血樣并做好標(biāo)記。 分別向三個(gè)孔中加入BPPD、APPD 和PBS 進(jìn)行刺激后， 震蕩1 分鐘置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～24 小時(shí)。 孵育完成后， 收集上清液于1.5 毫升離心管中，即為γ-干擾素上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.4 牛結(jié)核病γ-干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（IFN-γ-ELISA）

試驗(yàn)前將所有試劑（除結(jié)合物）恢復(fù)至21℃±3℃。溶解凍干試劑，并平衡15 分鐘。

每孔加入100 微升待檢樣品（不需稀釋）和對照品（陽性、陰性和空白對照各一孔， 陰性對照加入到H10 孔， 陽性對照加入到H11 孔，空白對照H12 孔）至相應(yīng)孔中。 在微量振蕩器上振蕩1 分鐘， 徹底混勻。 封板，室溫（21℃±3℃）孵育1 小時(shí)。 洗滌4 次。 洗液按配制方法制備，洗滌方法如下：迅速翻轉(zhuǎn)ELISA板以倒空其內(nèi)液體， 避免孔與孔之間的液體混合， 每孔中添加300 微升的洗液，輕搖微孔板，避免造成不同孔間的污染，迅速翻轉(zhuǎn)ELISA 板以倒空其內(nèi)液體，重復(fù)操作3 次。第4 次洗滌完畢后， 將酶標(biāo)板放在干凈的濾紙上拍打幾次， 盡量除去殘留的洗液。 每孔加入100 微升新鮮配制的酶標(biāo)結(jié)合物，充分振蕩混勻。封板，室溫（21℃±3℃）孵育1 小時(shí)，洗滌4 次。洗滌方法同上。每孔加入100 微升底物溶液（TMB），充分振蕩混合。封板，21℃±3℃避光孵育10分鐘。 每孔加入50 微升終止液，輕輕搖動混勻， 終止后5 小時(shí)內(nèi)讀取OD450 納米的值。

1.4 判定方法

1.4.1 布魯氏菌病

虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)中陰陽對照成立，“++++”為出現(xiàn)大的凝集片或小的粒狀物， 液體完全透明，100%凝集；“+++”為有明顯的凝集片， 液體幾乎完全透明，75%凝集；“++”為有可見的凝集片，液體不甚透明，50%凝集；“+” 液體混濁， 只有少量顆粒物，25%凝集；“-”為液體均勻混濁。當(dāng)被檢血清1∶100 稀釋度時(shí)，出現(xiàn)“++”以上的凝集現(xiàn)象則判定為陽性，1∶50 稀釋度時(shí)出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象則判定為可疑， 出現(xiàn)可疑反應(yīng)的奶牛間隔一段時(shí)間后再次進(jìn)行檢測， 若結(jié)果仍為可疑，則可判定為陽性。

1.4.2 牛結(jié)核病

1.4.2.1 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（TST）

注射72 小時(shí)后測量的中央皮皺厚度與原皮厚度的皮厚差大于或等于4 毫米以上， 且有明顯的炎癥反應(yīng)則判定為陽性， 用符號“+”表示；皮厚差2～3.5 毫米，有輕微炎癥反應(yīng)即為可疑反應(yīng)， 用符號“±”表示；皮厚差在2 毫米以下，無炎癥反應(yīng)發(fā)生，則判定為陰性反應(yīng)，用符號“-”表示；若判定結(jié)果為可疑反應(yīng)的奶牛，間隔一段時(shí)間后進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果仍為可疑反應(yīng)，則判定為陽性。

1.4.2.2 比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（SICTT）

首先， 根據(jù)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，挑選出判定為牛型結(jié)核菌素陽性結(jié)果，牛型結(jié)核菌素皮厚差減去禽型結(jié)核菌素皮厚差的差值大于4 毫米則判定為陽性；若牛型結(jié)核菌素皮厚差減去禽型結(jié)核菌素皮厚差的差值大于1 毫米小于4 毫米則判定為可疑；若牛型結(jié)核菌素為陰性結(jié)果，或牛型結(jié)核菌素為陽性結(jié)果但皮厚差小于等于禽型結(jié)核菌素皮厚差的則判定為陰性。

1.4.2.3 IFN-γ-ELISA試驗(yàn)

當(dāng)測得的BPPD 的OD值減去APPD 的OD 值大于或等于0.1，且BPPD 的OD值減去PBS 的OD 值大于或等于0.1 時(shí)， 判定結(jié)果為牛結(jié)核陽性；當(dāng)測得的BPPD 的OD 值 減 去APPD 的OD 值小于0.1，或BPPD 的OD 值減去PBS 的OD 值小于0.1 時(shí)， 判定結(jié)果為牛結(jié)核陰性；當(dāng)測得的APPD 的OD 值大于或等于BPPD 的OD 值， 且APPD 的OD 值減去PBS 的OD 值大于或等于0.1時(shí)，判定結(jié)果為禽結(jié)核陽性。

2 結(jié)果

2.1 牛布魯氏菌病

使用虎紅平板凝集試驗(yàn)對315份奶牛血清進(jìn)行初步檢測，檢出陽性血清為122 份，陽性率為38.7%。使用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢，檢出陽性血清為115 份， 陽性率為36.51%。

2.2 牛結(jié)核病

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果

使用牛型結(jié)核菌素和禽型結(jié)核菌素進(jìn)行皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、比較變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、牛結(jié)核病γ-干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （IFN-γ-ELISA）結(jié)果見表1。由表1 可知，使用比較變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果中，有10 份可疑陽性結(jié)核出現(xiàn)， 其皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、比較變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、牛結(jié)核病γ-干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（IFN-γ-ELISA）的數(shù)據(jù)結(jié)果見表2，其判定結(jié)果見表3。

表1 不同試驗(yàn)方法檢測結(jié)果

2.2.2 結(jié)果分析

使用牛型結(jié)核菌素對314 頭奶牛進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)， 檢出121份結(jié)果大于4 毫米， 陽性率為38.54%；使用禽型結(jié)核菌素進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，檢出33 份結(jié)果大于4毫米，陽性率為10.51%。 比較變態(tài)反應(yīng)結(jié)果為89 份陽性， 其中有2份為禽型陽性，10 份為可疑。 通過采集奶牛血液，對奶牛血液進(jìn)行全血培養(yǎng)后收集到的γ-干擾素上清液進(jìn)行IFN-γ-ELISA 試驗(yàn)，結(jié)果表明檢測出有154 份陽性血液，陽性率為49.04%。

表2 10 頭可疑牛不同方法試驗(yàn)結(jié)果

對于以上試驗(yàn)方法進(jìn)行綜合判定，結(jié)果表明121 頭為牛型結(jié)核陽性，33 頭禽型結(jié)核陽性，其中29頭為牛型、禽型混合感染。 上述在比較變態(tài)反應(yīng)中有10 份為可疑結(jié)核病奶牛， 其中耳號為160012 和160009 奶牛，APPD 變態(tài)反應(yīng)判定為陰性，BPPD 變態(tài)反應(yīng)、IFN-γ-ELISA 均判定為陽性， 綜合判定為陽性；耳號為160819 和170721 奶牛，僅比較變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)中判定為可疑， 而其余試驗(yàn)中均為陰性，則綜合判定為陰性； 耳號為160917和170054 奶牛， 比較變態(tài)反應(yīng)中判定為可疑，APPD 變態(tài)反應(yīng)和BPPD 變態(tài)反應(yīng)判定為陰性，IFNγ-ELISA 判定為陽性，綜合判定均為陽性； 耳號為110113 和150812奶牛，APPD 變態(tài)反應(yīng)和BPPD 變態(tài)反應(yīng)判定為陽性，比較變態(tài)反應(yīng)中判定為可疑，IFN-γ-ELISA 判定為陰性，綜合判定為陽性；耳號為150920 和150943 奶牛，APPD 變態(tài)反應(yīng)判定為陰性，BPPD 變態(tài)反應(yīng)判定為陽性，比較變態(tài)反應(yīng)中判定為 可 疑，IFN-γ-ELISA 判 定 為 陰性，則綜合判定結(jié)果為陽性。

表3 10 頭可疑牛不同方法判定結(jié)果

2.2.3 綜合判定結(jié)果

綜合上述分析， 在檢測的314頭奶牛中，共檢測出牛型結(jié)核陽性121 頭（其中29 頭為牛型、禽型雙陽性），10 頭可疑牛中8 頭確定為陽性。 牛型結(jié)核陽性率為38.54%，禽型結(jié)核陽性率為10.51%， 牛型、禽型雙陽率為9.24%。

3 討論

2019 年對石家莊欒城區(qū)奶牛場存欄奶牛的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，牛布魯氏菌病和結(jié)核病的陽性率仍處于較高水平，表明“兩病”在養(yǎng)牛業(yè)廣泛流行，嚴(yán)重影響了奶牛的正常飼養(yǎng)，阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

奶?！皟刹　睓z出的陽性率處于較高水平， 主要原因在于引進(jìn)奶牛檢疫不嚴(yán)格，防疫意識差，“兩病”陽性奶牛的無害化處理困難兩個(gè)方面。 首先， 我們應(yīng)加強(qiáng)對奶牛春秋季“兩病”的定期監(jiān)測，及時(shí)掌握“兩病”的發(fā)生發(fā)展動態(tài)，做到“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早報(bào)告、嚴(yán)處置”，確保全市人民的健康及畜牧業(yè)的發(fā)展。

其次， 根據(jù)國家檢疫部門下發(fā)的相關(guān)規(guī)定， 對于自己養(yǎng)殖場內(nèi)檢測出的“兩病” 陽性奶牛應(yīng)進(jìn)行淘汰， 這樣會造成養(yǎng)殖戶對于政府檢測部門政策的不滿， 同時(shí)又會加重政府的財(cái)政負(fù)擔(dān)， 使檢疫工作無法順利展開。 對于政府部門應(yīng)加強(qiáng)領(lǐng)導(dǎo)，提高“兩病”檢測陽性奶牛淘汰補(bǔ)助標(biāo)準(zhǔn)，使其規(guī)范化、制度化，確保對于監(jiān)測出的陽性病畜順利進(jìn)行無害化處理。

再次， 政府部門應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)氐奶攸c(diǎn)， 對養(yǎng)殖戶進(jìn)行疫情防疫的知識普及，使人們對于“兩病”的危害有一個(gè)更為清晰的認(rèn)識， 通過不斷的宣傳工作提高養(yǎng)殖戶的相關(guān)專業(yè)素養(yǎng)，讓人們深刻明白“兩病”對人類生命安全及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的危害，并注重養(yǎng)殖場的規(guī)范性， 以更好地對“兩病”進(jìn)行防控，消滅“兩病”的傳染源。

（支持項(xiàng)目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù) 體 系 奶 牛 創(chuàng) 新 團(tuán)（HBCT2018120406；

HBCT2018120205），河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系肉牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（HBCT2018130405））