曹乾忠，洪滿珠，唐細(xì)蘭,

(1.中山大學(xué)中山眼科中心，眼科學(xué)國家重點實驗室 510080；2.廣州愛爾眼科醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510060)

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)存在于許多脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病[1]，其中年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是老年人失明和視力損害的主要病因之一。滲出型AMD以新生血管形成為特征，病理特點主要是 CNV形成后，穿透Bruch's膜進入到通常無血管的視網(wǎng)膜下空間，進而引起視網(wǎng)膜的損害，嚴(yán)重影響視力[2]。De Jong[3]發(fā)現(xiàn)盡管只有10%AMD患者發(fā)展成新生血管性AMD，但它卻是引起90%以上AMD患者中央視力惡化的病因，從而嚴(yán)重影響患者的日?；顒?。近年來，為研究滲出型AMD的發(fā)病機制，研究者建立了許多動物模型，對研究AMD病情的發(fā)生發(fā)展具有重要意義[4-6]。很多研究[3,7]顯示用小鼠作為AMD的研究模型成功率高、機制研究充分、可重復(fù)性好，且相關(guān)的檢查方法成熟。麻醉劑的選擇和能量設(shè)置是動物CNV模型誘導(dǎo)的關(guān)鍵，為優(yōu)化構(gòu)建AMD動物模型，本研究采用Phoenix Micron IV視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)自帶的532 nm激光器，選擇不同激光能量對CNV造模成功率的影響，比較水合氯醛和阿佛丁兩種藥物對小鼠的麻醉作用，以期望對后期研究提供指導(dǎo)和幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥物

C57/BL6小鼠，雌性，6～8周，體重為(20±2) g，來源于廣東省實驗動物中心[SCXK(粵)2010-0058]，在中山大學(xué)中山眼科中心SPF級飼養(yǎng)環(huán)境[SYXK(粵)2015-0058]中飼養(yǎng)(倫理編號為2015-118)。使用的藥物包括鹽酸丙美卡因滴眼液(比利時愛爾康公司)、復(fù)方托比卡胺滴眼液(沈陽興齊眼藥股份有限公司)、2%羥丙基甲基纖維素滴眼液(中山大學(xué)附屬眼科醫(yī)院制劑)、妥布霉素眼膏(比利時愛爾康公司)、10%熒光素鈉注射液[廣西梧州制藥(集團)股份有限公司]、阿佛丁(日本TCI公司)和阿佛丁溶劑叔戊醇(德國Sigma公司)。

1.2 小鼠分組

小鼠隨機分為3組，每組8只，每組設(shè)定的激光能量分別為200，300和400 mW，光凝時間為100 ms，激光光斑大小為50 μm。

1.3 小鼠激光光凝誘導(dǎo)的CNV模型的建立

麻醉：小鼠使用4.3%水合氯醛麻醉用量為10 μL/g，1.2%阿佛丁為20 μL/g。

激光視網(wǎng)膜光凝：鹽酸丙美卡因滴眼液滴眼1次，復(fù)方托比卡胺滴眼液滴眼散瞳2次，2%羥丙基甲基纖維素滴眼液滴眼1次。觀察瞳孔散大后利用Phoenix Micron IV視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)和激光系統(tǒng)(美國Phoenix研究實驗室)，避開血管于小鼠視盤周約2個視盤直徑，上、下、左、右各激發(fā)1次，共4點/眼；以看到有氣泡產(chǎn)生為Bruch's膜擊穿特征；完成后涂妥布霉素眼膏1次；小鼠加熱墊保溫、觀察至蘇醒。

1.4 熒光素眼底血管造影

分別于光凝后4，7，10，14 d各時間點對小鼠散瞳及麻醉，麻醉方法同前，腹腔內(nèi)注射100 g/L熒光素鈉注射液0.05 mL，行熒光素眼底血管造影檢查。

1.5 SD-OCT檢查

小鼠麻醉后，用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，鹽酸丙美卡因滴眼液滴眼1次，2%羥丙基甲基纖維素眼水滴眼1次。用海德堡OCT儀器SPECTRALIS(德國SPECTRALIS)對小鼠視網(wǎng)膜眼底行OCT檢查，著重對激光光凝的斑點進行斷層掃描。

1.6 小鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜鋪片和IB4染色

在第14天處死小鼠，以供鋪片和IB4染色。頸椎脫臼法處死小鼠，摘除眼球，放入4%多聚甲醛溶液中固定2 h，剝離眼外肌等組織，然后用眼科剪去除角膜結(jié)膜和晶狀體等結(jié)構(gòu)，只留下視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜等組織。將視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜分離，放入到含有10 μg/mL，AF488偶聯(lián)同工凝集素B4(Isolectin B4，IB4；美國Thermo Scientific公司)的溶液中過夜染色，溫度為4 ℃，次日進行視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜鋪片。用熒光顯微鏡Zeiss Observer A1(德國Zeiss公司)進行熒光觀察。

1.7 圖像面積計算和統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。圖像面積計算用Image Pro Plus 6.0軟件，面積大小用像素表示。率的比較用卡方檢驗；定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析，兩組間比較用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同麻醉藥對C57/BL6小鼠發(fā)生白內(nèi)障的影響

按照Vincent Lambert等[3]的操作步驟使用不同麻醉劑對C57/BL6小鼠進行麻醉，結(jié)果顯示：相比于阿佛丁，水合氯醛誘導(dǎo)小鼠進入麻醉的時間更長，且麻醉時長更長；阿佛丁的毒性比水合氯醛更大，但麻醉引起的白內(nèi)障差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

2.2 不同激光能量下CNV造模成功率的比較

使用200，300和400 mW的激光能量造模效果見表2。結(jié)果顯示：隨著激光能量的遞增，CNV成功率也逐漸升高。在激光能量達到400 mW時，SDOCT顯示視網(wǎng)膜色素上皮被擊穿，呈現(xiàn)不連續(xù)的狀態(tài)(圖1)。CNV出現(xiàn)的FFA溢漏大小較均一，而且IB4染色面積比較大(圖2，3)。FFA染色顯示在第4天時滲漏最為明顯，隨著激光能量的提高，熒光素滲漏區(qū)增多。

表1 不同麻醉劑對C57小鼠的影響Table 1 Effect of different anesthetics on C57 mice

表2 不同激光能量CNV造模成功率Table 2 Successful rate of CNV model under different laser energy hierarchy

圖1 不同激光能量SD-OCT檢查結(jié)果Figure 1 SD-OCT results of retinal photocoagulation areas with different laser energy

圖2 不同能量造模時激光斑和FFA結(jié)果Figure 2 Fundus color photography and FFA results of laser spots with different energy hierarchy

圖3 光凝后14 d不同激光能量下的脈絡(luò)膜平鋪片IB4檢查結(jié)果Figure 3 Comparison of IB4 staining areas of flat-mounted choroid with different laser energy 14 days after laser burn

3 討論

使用激光誘導(dǎo)CNV能夠構(gòu)建理想的AMD模型[5]。動物模型構(gòu)建是研究藥物治療CNV的前提。CNV又稱視網(wǎng)膜下新生血管，常見于許多眼底疾病，如老年性黃斑變性、特發(fā)性脈絡(luò)膜新生血管和中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變等[8]，是這些疾病的基本病理改變。CNV來自于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管，經(jīng)Bruch's膜入侵，Bruch's膜增厚、破裂以及變性等都是產(chǎn)生CNV的前提條件[9]。CNV的形成經(jīng)歷了血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管基底膜被覆，血管腔形成及周圍纖維組織增生等多個病理過程。機體各種新生血管生長因子均可引起血管異常生長，而其中又以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及其信號通路尤為重要，起到關(guān)鍵作用[10]，這為臨床治療提供了靶點。CNV常嚴(yán)重?fù)p害患者的視力，降低人們的生活質(zhì)量[11]。

激光能量是CNV造模的關(guān)鍵。激光能量過低，CNV成功率很低，達不到研究的要求；如果能量過高，則會形成一個“固定孔(Solid Hole)”，這為后續(xù)用藥物治療CNV的研究帶來困擾[7]。Giani等[12]也采用532 nm激光器進行C57小鼠能量梯度的對比試驗，分別比較180，240，300及360 mW CNV成功率，發(fā)現(xiàn)能量設(shè)置為240 mW時成功率最高，這與本研究的400 mW存在差異，可能原因包括房間的濕度、溫度、能量傳輸過程中的衰減及對焦的準(zhǔn)確度等，都會影響激光實際作用能量的大小，機器設(shè)定的能量值與實際起作用的能量大小存在差異，因此在具體實驗時，應(yīng)該對激光能量進行調(diào)整，結(jié)合SD-OCT和FFA，確認(rèn)所在實驗室的最佳激光能夠量參數(shù)。

Lambert等[13]認(rèn)為水合氯醛會增加C57/BL6患白內(nèi)障和腹腔臟器粘連的風(fēng)險，建議用阿佛丁替代。本研究結(jié)果顯示：水合氯醛不會增加C57/BL6小鼠患不可逆性白內(nèi)障的發(fā)病率，在復(fù)蘇率和病死率方面兩組沒有差別；且相對于阿佛丁，水合氯醛小鼠麻醉維持時間長，有利于小鼠實驗操作。

綜上所述，水合氯醛的麻醉維持時間比阿佛丁長，并未出現(xiàn)加重不可逆性白內(nèi)障的風(fēng)險；Phoenix Micron IV視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)532 nm激光在400 mW激光能量時，能夠做出CNV理想的小鼠AMD動物模型。

致謝

感謝哈佛醫(yī)學(xué)院Gong Yan博士對本課題在實驗設(shè)計和實驗方案的優(yōu)化上提出寶貴意見。