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        橄欖苦苷對染砷小鼠大腦神經(jīng)免疫相關基因表達的影響*

        2020-01-09 03:20:50
        關鍵詞:加壓素精氨酸垂體

        王 昱

        (隴南師范高等專科學校農(nóng)林技術學院,隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心,甘肅 成縣 742500)

        0 引 言

        我國飲水型砷中毒分布廣、影響人群多,是環(huán)境砷中毒的主要類型[1].砷通過食物鏈或飲用水進入人體,容易蓄積,潛伏期長,危害大.研究顯示,慢性飲水型高砷暴露使動物的空間學習、記憶能力下降[2],損傷神經(jīng)元或增加神經(jīng)系統(tǒng)損傷易感性[3],誘導凋亡人膠質(zhì)瘤細胞[4],干擾動物大腦組織白細胞介素(IL,interleukin)家族部分基因和下丘腦-垂體-腎上腺軸受體相關基因的表達[5],抑制機體的細胞免疫、體液免疫、巨噬細胞及淋巴細胞系統(tǒng)整體功能[6-7].橄欖苦苷(OP,oleuropein)屬于天然的多酚化合物,是油橄欖中最主要的含量最多的活性成分[8].本課題組前期已經(jīng)研究了OP在降血糖、抗衰老及降血脂等方面的藥理作用[9-11].為了進一步研究OP的藥理作用,本研究在三氧化二砷(As2O3)染毒小鼠的基礎上給予OP干預,觀察大腦組織部分神經(jīng)免疫相關基因表達的變化,探討其拮抗神經(jīng)毒性的保護作用.

        1 材料與方法

        1.1 動物模型建立與給藥

        健康昆明小鼠30只(購于蘭州大學實驗動物中心,生產(chǎn)許可證編號:14-006,體質(zhì)量 18~20 g,雌雄各半),同條件飼養(yǎng)1周后隨機分為3組(每組10只):As2O3組、As2O3+OP組和對照組.As2O3組每天灌胃4 mg/kg劑量的As2O3溶液[12];OP組灌胃4 mg/kg劑量的As2O3溶液,同時灌胃100 mg/kg的OP[10](隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司提供);對照組每天灌胃等量的0.9% 生理鹽水.3組實驗連續(xù)處理5周后,斷頭處死小鼠,立即取大腦儲存于RNA保存液中,備用.

        1.2 總RNA 的提取和基因芯片雜交

        分別研磨各組實驗小鼠大腦,按照TRIzol 試劑盒(美國Invitrogen 公司)操作說明從中抽提總RNA,用RNeasy Mini Kit(美國Oiagen公司)進行純化.用UV-1800紫外分光光度儀(日本Tokyo)測定RNA 的濃度和純度,變性膠電泳(美國Sigma公司DEPC水和溴酚藍,Bocherigmer公司MOPs緩沖液)檢測RNA 有無降解,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA、體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA 探針,同時用生物素標記探針,片段化處理探針,45℃下在雜交箱640 (美國Affymetrix 公司)中與Mouse Genome 4302.0 Araay 基因芯片雜交16 h,全自動芯片洗滌工作站450(美國Affymetrix 公司)中洗脫、染色;最后用GeneArrayTM掃描儀3000(美國Affymetrix 公司)掃描雜交信號.

        1.3 芯片數(shù)據(jù)處理和生物學信息分析

        采用Microarray Suite Version 5.0軟件(美國Affymetrix 公司)進行分析,在對單個樣本表達分析的前提下,建立對照組、As2O3組、As2O3+OP組基因表達譜,其中P>0.06 為不表達,P<0.04為表達,P值在0.04~0.06 為臨界值.將各組實驗的基因表達譜進行組間比較,根據(jù)信號強度比值的對數(shù)(signal log ratio,SLR)判斷.SLR>1(即表達倍數(shù)>2)為表達上調(diào),SLR<-1(即表達倍數(shù)<2)為表達下調(diào),建立各組差異表達的數(shù)據(jù)庫.

        2 結(jié) 果

        2.1 IL家族基因的表達

        OP對小鼠大腦IL家族基因表達的影響結(jié)果列于表1.與對照組相比,As2O3組小鼠大腦組織基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-1f6、IL-13、IL-25和IL-24表達均下調(diào),IL-17d表達上調(diào).與As2O3組比較,As2O3+OP組小鼠大腦組織基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-25和IL-24表達下調(diào),IL-1f6和IL-17d表達上調(diào),IL-13表達無差異.除了基因IL-15、IL-24外,其他基因在對照組與As2O3+OP組小鼠大腦組織的表達無差異.不同組間IL家族基因差異表達倍數(shù)結(jié)果顯示,OP干預后,基因表達變化幅度減小,說明OP干預有效.

        表1 不同組間小鼠大腦白細胞介素家族基因差異表達倍數(shù)

        注:OP為橄欖苦苷;As2O3為三氧化二砷;IL為白細胞介素.

        2.2 IL家族受體基因的表達

        OP對小鼠大腦IL家族受體基因表達譜數(shù)據(jù)列于表2.與對照組比較,As2O3組小鼠大腦組織基因IL-13受體α1(IL-13ral)和IL-2受體 γ 鏈(IL-2rg)表達上調(diào),IL-17受體C (IL-17rc)表達下調(diào).與As2O3組比較,As2O3+OP組小鼠大腦組織基因IL-13ral、IL-12rg和IL-17rc表達上調(diào).基因IL-13ral、IL-2rg和IL-17rc在對照組與As2O3+OP組小鼠大腦組織的表達無差異.As2O3+OP組與As2O3組的基因差異表達倍數(shù)均小于As2O3組與對照組的表達倍數(shù)絕對值,說明OP干預有效.

        2.3 丘腦-垂體-腎上腺軸相關基因表達

        OP對小鼠大腦下丘腦-垂體-腎上腺軸相關基因表達結(jié)果列于表3.與對照組比較,As2O3組小鼠大腦組織基因促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1(Crhr1)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體2(Crhr2)、精氨酸加壓素(Avp)、精氨酸加壓素受體1B(Avpr1b)、精氨酸加壓素受體1A(Avpr1a)、精氨酸加壓素受體2(Avpr2)表達下調(diào),促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Crh)和阿黑皮素原α(Pomc1)表達上調(diào).與As2O3組比較,As2O3+OP組小鼠大腦組織基因Crhr1、Crhr2、Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2表達下調(diào),Crh和Pomc1表達上調(diào).除了基因Crhr2外,其他基因在對照組與As2O3+OP組小鼠大腦組織的表達無差異.同上,組間基因差異表達倍數(shù)絕對值變小,說明OP干預有效.

        表2 不同組間小鼠大腦白細胞介素家族受體基因差異表達倍數(shù)

        注:IL-13ral為IL-13受體α1;IL-2rg為IL-2受體 γ 鏈;IL-17rc為IL-17受體C.

        表3 不同組間小鼠大腦下丘腦-垂體-腎上腺軸相關基因差異表達倍數(shù)

        注:Crh為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素;Crhr1為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1;Crhr2為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體2;Avp為精氨酸加壓素;Avpr1b為精氨酸加壓素受體1B;Avpr1a為精氨酸加壓素受體1A;Avpr2為精氨酸加壓素受體2;Pomc1為阿黑皮素原α.

        3 討 論

        砷可通過血液和腦脊液進入腦實質(zhì)而損傷腦組織,導致腦功能失調(diào)[5].中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放的IL可作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),影響免疫系統(tǒng)特定的功能,而且還可能參與神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)間的相互調(diào)節(jié).本實驗利用基因芯片技術分析結(jié)果顯示,As2O3組小鼠大腦IL家族基因及受體基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-1f6、IL-13、IL-25、IL-24和IL-17rc表達水平顯著低于對照組,IL-17d、IL-13ral和IL-2rg表達水平顯著高于對照組,說明上述IL家族部分基因表達水平的變化,可能與砷的免疫毒性作用有關,這與王艷艷等[5]的研究結(jié)果一致.經(jīng)OP干預后,染砷小鼠大腦組織IL家族部分基因的表達水平與對照組表達無差異,提示通過調(diào)節(jié)大腦IL家族基因的表達是減輕砷致免疫毒性的途徑之一.

        下丘腦-垂體-腎上腺軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分,已有研究表明,大腦組織Crh的相關基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1和Crhr2等是調(diào)控腎上腺皮質(zhì)激素分泌的重要基因[5],這些基因下調(diào)會導致促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌減少,引起腎上腺皮質(zhì)萎縮,分泌功能減退,進而抑制免疫功能.本研究顯示,染砷小鼠大腦組織下丘腦-垂體-腎上腺軸受體相關基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1、Crhr2表達水平均低于對照組,這進一步表明砷可能影響神經(jīng)免疫調(diào)控功能的重要生物信息.經(jīng)OP干預后,染砷小鼠大腦組織下丘腦-垂體-腎上腺軸受體相關基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1、Crhr2的表達變化幅度均變小,這表明OP影響了小鼠大腦組織內(nèi)下丘腦-垂體-腎上腺軸受體相關基因的表達,但還需進一步探討.

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