華春秀，張科，劉慶春，李冰潔，宋國英，薛士鵬，于瑞雪，王中曉，張慶遠，劉麗，夏西超,,*

1. 南陽醫(yī)學高等?？茖W?；A醫(yī)學部，南陽 473061 2. 平頂山學院醫(yī)學院，平頂山 476000

五氯苯酚(PCP)廣泛應用于農藥、木材防腐劑和個人護膚品等工農業(yè)生產中，目前，在地表水、地下水、污水和飲用水中都不同程度地被檢測到[1-3]。PCP存在能夠給水生生物和人類生存帶來顯著的健康威脅，已被美國、中國和歐洲等國家和地區(qū)定為一種具有嚴重危害的持久性污染物[4-6]。在我國，PCP主要用于殺滅血吸蟲的中間宿主，由于其持久性的存在，在大多數(shù)河流中仍然被廣泛發(fā)現(xiàn)[1,7-8]。谷胱甘肽S-轉移酶(GST)屬于機體Ⅱ相生物轉化系統(tǒng)酶類，催化谷胱甘肽(GSH)與廣泛外源性或內源性有毒化合物親電中心結合，如癌癥化療藥物、化學致癌物、農藥、除草劑和氧化應激產物[9-10]。在哺乳動物中，根據(jù)GST底物特異性、免疫學性質和蛋白質序列的同源性，把GST劃分為α、μ、π、θ、σ、ζ和ω等7個大類[11]。在氧化應激條件下，GST表達水平被視為是一種適應性反應，GST表達被認為是受氧化應激動物的分子標志物[12-13]。背角無齒蚌(Anodontawoodiana)作為淡水底棲生物的重要類群，在淡水環(huán)境監(jiān)測中具有重要作用[14-15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PCP處理對背角無齒蚌產生顯著的毒性傷害和應激效應，具體機制有待進一步探討[16]。在本研究中，從背角無齒蚌中克隆出ρ型谷胱甘肽S-轉移酶完整基因序列并命名為ρ-GST，通過real-time PCR分析ρ-GST時空表達，為揭示PCP毒性效應奠定理論基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 背角無齒蚌處理

背角無齒蚌購自南陽市水產市場，殼長(6.5±0.5) cm，處理之前，動物置于實驗室自動水循環(huán)系統(tǒng)中適應養(yǎng)殖2周。PCP購自Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，溶解于二甲亞砜(DMSO)中以制備儲備液。動物處理實驗在長方形塑料盒(40 cm×25 cm；10 cm高)中進行，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[16]，每天更換水，動物喂食小球藻。為了確定ρ-GST組織分布，對來自同一塑料盒的5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。根據(jù)上述動物處理方法，將80只河蚌隨機飼養(yǎng)于10個塑料盒中，每盒8只，分為對照組和PCP處理組，每組5個盒子。PCP處理組采用13.9 mg·L-1的PCP進行處理，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。0、1、3、6、9、12和15 d從每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

總RNA提取采用TRIzol試劑(寶生物生物有限公司，大連)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，具有完整rRNA條帶的RNA用于合成cDNA，M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應模板。

1.3 背角無齒蚌ρ-GST核心片段的擴增

簡并引物ρ-GST1和ρ-GST2分離ρ-GST cDNA保守區(qū)域片段，PCR產物連接至pMDT-19載體，雙向測序。確定ρ-GST部分cDNA序列后，根據(jù)部分cDNA序列設計的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，擴增ρ-GST cDNA 5’和3’區(qū)域序列，5’RACE和3’RACE的PCR產物進行測序和拼接。

1.4 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

分析ρ-GST序列，通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行BLAST程序比對；根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP預測信號肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白質結構域；使用DANMEN分析程序對ρ-GST基因進行多序列比對；通過Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org/)預測ρ-GST的蛋白質三維結構；使用MEGA5.0軟件，采用臨近法構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 ρ-GST mRNA水平定量檢測

為了確定ρ-GST轉錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進行定量分析。β-actin作為內參基因，根據(jù)ρ-GST-F和ρ-GST-R引物常用PCR儀中分離靶基因(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測出一個條帶，PCR產物測序，序列鑒別。使用ABI7500實時檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)進行real-time PCR，構建標準曲線，通過2-△△CT分析ρ-GST表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果(Results)

2.1 背角無齒蚌ρ-GST分子結構

背角無齒蚌ρ-GST cDNA全長為1 026 bp，包含了57 bp的5’非編碼區(qū)、291 bp的3’非編碼區(qū)和一個678 bp的開放閱讀框。開放閱讀框為226個氨基酸組成的多肽，分子質量為26.80 kDa，等電點為6.38。終止信號(AATAAA)位于3’UTR的986～991處(圖1)。預測氨基酸序列包括N端G-位(殘基8～85)和C端H-位點(殘基92～204)2個保守區(qū)域(圖1)。

背角無齒蚌ρ-GST和其他水生軟體動物GSTs之間的多重序列比對結果表明，所有GSTs的N-端區(qū)域同源性較高，并且相對保守，而C-端相對多變(圖2)。在ρ-GST中，N端部分是谷胱甘肽S-轉移酶催化的必要條件，通過穩(wěn)定二硫鍵來激活被束縛的GSH。在該區(qū)域中，Try7、Ser13、Pro15、Phe38、His42、Lys43、Glu69和Ser70都是所有谷胱甘肽S-轉移酶序列中的保守氨基酸，G-位點上這些氨基酸與GST結合有關(圖2)。

圖2 背角無齒蚌ρ-GST與其他物種GST序列多重比對注：G-位點保守氨基酸殘基用星號表示。CgGST為長牡蠣谷胱甘肽S-轉移酶(EKC36795.1)，HdGST為皺紋盤鮑(Haliotis discus discus) 谷胱甘肽S-轉移酶A(ABO26605.1)，LeGST為南極帽貝(Laternula elliptica)ρ型谷胱甘肽S-轉移酶(ACM44933.1)，RpGST為菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)ρ型谷胱甘肽S-轉移酶(AEW46331.1)。Fig. 2 Multiple alignment of ρ-GST of Anodonta woodiana compared with other GSTSsNote: CgGST is Crassostrea gigas glutathione S-transferase A (EKC36795.1); HdGST is Haliotis discus discus glutathione S-transferase A (ABO26605.1); LeGST is Laternula elliptica rho-class glutathione S-transferase (ACM44933.1); RpGST is Ruditapes philippinarum rho-class glutathione S-transferase (AEW46331.1). The conserved residues of G-sites are marked with asterisk.

2.2 AwGST1和AwGST2的二級和三級結構分析

ρ-GST蛋白質二級結構有12個α-螺旋和4個β-折疊組成(圖3A)。在N端G-位點有3個α-螺旋和4個β-折疊，C端的H-位點包含8個α-螺旋。ρ-GST的三維結構與其他物種ρ型谷胱甘肽S-轉移酶有高度的相似性(圖3B)。

圖3 背角無齒蚌ρ-GST二級和3D結構預測注：A. ρ-GST二級結構；B. ρ-GST的3D結構。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of ρ-GST deduced amino acids of Anodonta woodianaNote: A. The secondary structure of ρ-GST; B. The 3D structure of ρ-GST.

2.3 背角無齒蚌ρ-GST系統(tǒng)進化

背角無齒蚌ρ-GST氨基酸序列與腹足綱皺紋盤鮑GST有55%同源性，與雙殼綱長牡蠣(Crassostreagigas)GST有55%同源性，與腹足綱南極帽貝ρ-GST有50%同源性，與菲律賓蛤仔GST有46%同源性(表2)。

表2 背角無齒蚌ρ-GST與其他物種GST序列同源性比較Table 2 Percentage of identity respectively for pairwise alignment of ρ-GST protein sequences between Anodonta woodiana and other species

注：HdGST為皺紋盤鮑谷胱甘肽S-轉移酶A(ABO26605.1)，CgGST為長牡蠣谷胱甘肽S-轉移酶(EKC36795.1)，AfGST為櫛孔扇貝(Azumapectenfarreri)ρ型谷胱甘肽S-轉移酶(ACF25903.1)，LeGST為南極帽貝ρ型谷胱甘肽S-轉移酶(ACM44933.1)，RpGST為菲律賓蛤仔ρ型谷胱甘肽S-轉移酶(AEW46331.1)，DrGST為斑馬魚(Daniorerio)ρ型谷胱甘肽S-轉移酶(NP_001038525.1)。

Note: HdGST isHaliotisdiscusdiscusglutathione S-transferase A (ABO26605.1); CgGST isCrassostreagigasglutathione S-transferase A (EKC36795.1); AfGST isAzumapectenfarrerirho-class glutathione S-transferase (ACF25903.1); LeGST isLaternulaellipticarho-class glutathione S-transferase (ACM44933.1); RpGST isRuditapesphilippinarumrho-class glutathione S-transferase (AEW46331.1); DrGST isDanioreriorho-class glutathione S-transferase (NP_001038525.1).

圖4 背角無齒蚌ρ-GST氨基酸序列使用鄰接法構建的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic relationship of ρ-GST of Anodonta woodiana according to neighborhood-joining method

系統(tǒng)進化樹結果顯示，背角無齒蚌ρ-GST與軟體動物谷胱甘肽S-轉移酶A類群和ρ型GST親緣關系較近，谷胱甘肽S-轉移酶A類群和ρ型GST分為了一組(圖4)。研究結果顯示，從選擇的物種中，同一類型GST的不同個體之間保持較高的bootstrap值，特別是在θ型GST中，昆蟲家蠶(Bombyxmori)和脊椎動物之間bootstrap值達到99%。值得注意的是，2種類型GST之間，bootstrap值明顯減小，如ω型GST和ζ型GST、ω型GST和δ型GST、ζ型GST和σ型GST等。

2.4 背角無齒蚌ρ-GST表達水平的組織分布

背角無齒蚌ρ-GST廣泛表達于斧足、外套膜、閉殼肌、心臟、肝胰腺、血淋巴和鰓(圖5)。背角無齒蚌ρ-GST在肝胰腺中表達水平最高，在鰓、血淋巴、心臟、斧足和閉殼肌中次之，外套膜中表達水平較低(圖5)。

圖5 背角無齒蚌ρ-GST基因的空間表達注：每組數(shù)據(jù)來源于5只動物。Fig. 5 Real-time PCR analysis of ρ-GST transcript from different tissues of Anodonta woodianaNote: n = 5 replicates.

2.5 PCP對背角無齒蚌ρ-GST表達的影響

在肝胰腺中，與第0天相比，背角無齒蚌ρ-GST表達在第1～15天出現(xiàn)了明顯的波動。PCP處理對背角無齒蚌ρ-GST表達具有顯著影響。PCP處理后背角無齒蚌ρ-GST mRNA水平呈現(xiàn)時間依賴的上調模式。與對照組相比，ρ-GST表達水平在第1天、第3天和第15天分別增加18.18%、82.88%(P<0.05)和2.43倍(P<0.01) (圖6)。與對照組相比，PCP處理后背角無齒蚌鰓中ρ-GST表達水平增加了1.44倍以上(P<0.05) (圖7)。與對照組相比，PCP處理后背角無齒蚌血淋巴中ρ-GST表達水平在第3至15天顯著升高(圖8)。

圖6 五氯苯酚(PCP)對背角無齒蚌肝胰腺ρ-GST基因表達的影響注： n=5/組/時間點；*、**表示與相應對照組相比，有顯著差異(P<0.05、P<0.01)；#表示與0 d相比，有顯著差異(P<0.05)。Fig. 6 Temporal expression of ρ-GST in hepatopancreas of Anodonta woodiana after pentachlorophenol (PCP) challenge as measured by quantitative real-time RT-PCRNote: Bars represent means ± SE; n=5/each group/each time point. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group at the same time. # P<0.05, ## P<0.01 vs control group at the day 0.

3 討論(Discussion)

ρ-GST有N端區(qū)域和C-端區(qū)域2個不同區(qū)域；多重序列比對表明，ρ-GST的N端G-位點相對保守，而C端多變，提示這些特征與GST的功能有關。一般來說，供GSH結合的G位點具有高度特異性包含11個高度保守氨基酸：Tyr7、Arg13、Trp38、Lys46、Gln53、Leu54、Pro55、Gln66、Ser67、Glu98和Asp99[17-18]。前期研究表明，Tyr在穩(wěn)定結合GSH方面發(fā)揮重要作用[17-18]，提示ρ-GST的N端保守氨基酸殘基有助于結合GSH。H-位點是親電底物的結合點，C端的H-位點相對多變與適應更廣泛底物的結構有關[19-20]。

圖7 PCP對背角無齒蚌鰓ρ-GST基因表達的影響注：n=5/組/時間點；*、**表示與相應對照組相比，有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 7 Temporal expression of ρ-GST in gill of Anodonta woodiana after PCP challenge as measured by quantitative real-time RT-PCRNote: Bars represent means ± SE; n=5/each group/each time point. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group at the same time.

圖8 PCP對背角無齒蚌血淋巴ρ-GST基因表達的影響注：n=5/組/時間點；*、**表示與相應對照組相比，有顯著差異(P<0.05、P<0.01)；#表示與0 d相比，有顯著差異(P<0.05)。Fig. 8 Temporal expression of ρ-GST in hemocytes of Anodonta woodiana after PCP challenge as measured by quantitative real-time RT-PCRNote: Bars represent means ± SE; n=5/each group/each time point. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group at the same time. # P<0.05 vs control group at the day 0.

多序列比對結果顯示，ρ-GST氨基酸序列與長牡蠣和腹足綱皺紋盤鮑GST-A序列很相似，并與ρ型GST具有高度同源性。基于系統(tǒng)進化分析數(shù)據(jù)和氨基酸序列比對結果，ρ-GST應歸為ρ型GST。研究已表明，序列相似性程度在GST分類中沒有明確標準，GST同工酶的演化關系仍然存在廣泛爭議[21]。大家普遍認為，在一類GST個體中同源性超過40%劃分為一個類群，同源性小于25%類群劃分為其他類群[21]。θ類GST第一個關于子家族演化的描述表明，θ類GST在從有氧細菌到更高真核生物中都存在，呈現(xiàn)廣泛分布，序列具有高度保守性，是較為原始的類群[22]。σ類GST是從哺乳動物α、μ和π這3個類群中分離出來的，ρ和θ從α、μ、ρ和θ中分離出來[23]。由此可見，GST類群進化經(jīng)歷了從無脊椎動物到脊椎動物的復雜里程。

背角無齒蚌ρ-GST在肝胰腺中表達水平最高，在鰓、血淋巴、心臟、斧足和閉殼肌內中等表達，在外套膜表達水平較低，這提示ρ-GST這種表達模式可能與清除活性氧以及維持氧化和抗氧化細胞之間平衡有關。正常情況下，活性氧簇(ROS)保持相對較低水平，ROS會被一系列抗氧化劑酶迅速消除，以維持ROS水平和抗氧化劑酶活性之間的均衡。在雙殼類動物，肝胰腺是重要代謝器官，在解毒和外源性物質的降解方面發(fā)揮重要的作用[24]。軟體動物GST能降解水體農藥、有機污染物和其他有毒化學物質[25]。因此，肝胰腺ρ-GST mRNA水平高表達與環(huán)境中出現(xiàn)外源性有毒物質降解有關。

在整個實驗過程中，PCP明顯誘導背角無齒蚌肝胰腺、鰓和血淋巴中ρ-GST的表達，提示ρ-GST表達水平上調有助于參與PCP解毒過程和抗氧化過程。對于機體而言，ROS主要包括過氧化物陰離子、過氧化氫、烷基過氧化物、單線態(tài)氧和羥基自由基[26]。背角無齒蚌是濾食性淡水動物，PCP易沉積和過量積累在其體內，可以催化生成ROS[3-4]。GST廣泛分布在所有活細胞中并參與機體有毒物質降解，GST通過與毒素結合，能夠主動或者被動地與致癌物、治療制劑和氧化應激產物等外源性/內源性有毒物質結合[27-28]，促進細胞排毒和自我保護的作用。研究表明，正常情況下GST持續(xù)表達與機體解毒密切相關，而GST的高表達參與保護細胞免受內源性氧化應激的影響[27-29]。已有研究表明，諸多外界因素誘導GST表達，GST被認為是一種對抗異種生物化學毒性的有效解毒酶。高水平GST與農藥降解密切有關[30-31]。褐飛虱(Nilaparvatalugens)GST水平增高有助于抵抗氧化損傷，保護組織[32]。綜上所述，背角無齒蚌中ρ-GST表達上調在降低PCP導致的氧化應激和細胞損傷過程中發(fā)揮著積極作用。

PCP處理后ρ-GST表達水平在不同組織表現(xiàn)出不同特征。對于該現(xiàn)象，一種解釋可能與這些組織不同生理功能有關。軟體動物肝胰腺具有肝和胰腺雙重功能，參與消化和中和大量有毒物質[33-34]。鰓位于殼腔內，通過水體流動實現(xiàn)呼吸功能，直接與外部環(huán)境接觸，上皮組織非常薄[35]，鰓也是環(huán)境污染物作用的重要靶器官之一[36]。雙殼類血淋巴是防御病原侵染的重要防線，也是減少ROS生成的重要防線，通過吞噬作用和呼吸爆發(fā)過程消除環(huán)境污染物[37]。眾所周知，呼吸爆發(fā)過程與雙殼類血淋巴中重金屬和污染物所產生的氧化應激密切相關[37-38]。呼吸爆發(fā)在消除重金屬和污染物產生的毒性方面起著潛在的作用，一些復雜因素可能參與肝胰腺、鰓和血淋巴中ρ-GST表達調控。另一種解釋是ρ-GST可能在不同的組織和不同的發(fā)育階段扮演不同的角色。

與脊椎動物相比，軟體動物主要依靠自身的免疫能力，而血淋巴細胞是先天防御措施的主要途徑之一。維持機體穩(wěn)態(tài)是一個復雜過程，需要多個器官參與。在環(huán)境壓力下，一系列抗氧化酶表達在其中發(fā)揮重要的作用，高表達涉及保護細胞，抵抗內源性氧化應激。背角無齒蚌ρ-GST在肝胰腺、鰓和血淋巴中表達顯著增加有助于清除PCP處理產生的ROS，提高細胞氧化應激能力，實現(xiàn)機體穩(wěn)態(tài)。