孫靖淳,韓 冰

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，口腔頜面外科，吉林 長春130012)

唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)又稱涎腺腺樣囊性癌作為常見的頭頸部惡性腫瘤之一，是一種來源于潤管儲備細胞的上皮來源的高度惡性唾液腺腫瘤。典型的臨床及生物學(xué)特征為生長緩慢，但局部侵潤性強，高度嗜神經(jīng)性及肺轉(zhuǎn)移性，盡管完全的手術(shù)切除和輔助放療已被證實可以提高患者的長期生存率，但患者預(yù)后仍然較差。近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對頭頸部腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)深入研究以及隨著基因組學(xué)，表觀遺傳學(xué)，分子生物學(xué)等生物科學(xué)的發(fā)展及高通量測序的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換調(diào)控過程中起到了重要的作用，詳細的闡述了涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移、侵襲的相關(guān)機制，尋找對于腺樣囊性癌侵襲和轉(zhuǎn)移具有特異性的腫瘤標(biāo)記物可使該并的治療和預(yù)后評估產(chǎn)生重要意義，對于臨床治療涎腺腺樣囊性癌開拓了新的思路。本文就幾種非編碼RNA在涎腺腺樣囊性癌(SACC)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)調(diào)控機制的研究進展作一綜述。

1 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化emt是指在一定的病理或生理條件下，具有極性的上皮樣細胞向具有遷移能力的間充質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)化的過程。Emt過程會導(dǎo)致上皮樣表面分子markers表達減少，細胞極性喪失，細胞骨架發(fā)生改變重組；而細胞的侵襲和遷移能力大大增強[1]，上皮標(biāo)志物的丟失如E-鈣黏著蛋白(E-cadherin，E-cad)[2-4]，同時伴有間質(zhì)樣分子markers表達增多和抗凋亡能力增強[5]。

2 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換類型及生物標(biāo)志分子

2.1 依靠不同的生物學(xué)類型EMT基本可分為三種類型[6-8]。在哺乳動物生長發(fā)育過程中，emt在胚胎發(fā)育、原腸胚發(fā)育和神經(jīng)嵴形成中起到了重要的作用，尤其胚胎在顱頜面發(fā)育的過程中神經(jīng)脊細胞遷移形成神經(jīng)管，以及心瓣膜與肌肉骨的發(fā)育[9]。其次，在促進傷口愈合、組織再生和器官纖維化中，emt也扮演了重要的角色[10]。而在癌癥進程和腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，emt起到主要的調(diào)控作用，上皮樣腫瘤細胞受到腫瘤微環(huán)境的刺激，細胞骨架發(fā)生改變，細胞間黏附分子破壞，分化成具有遷移和運動能力的間質(zhì)樣腫瘤細胞[11-14]，發(fā)生emt轉(zhuǎn)換后的這些間質(zhì)樣腫瘤細胞會首先通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9等突破基底膜進入循環(huán)系統(tǒng)，最終在另一組織器官中行成新的轉(zhuǎn)移灶。在侵襲轉(zhuǎn)移過程中，發(fā)生emt的腫瘤細胞的凋亡也會受到抑制，能夠逃逸免疫系統(tǒng)的殺傷，并且對一些化療藥物的抵抗性增強。相關(guān)報道猜測emt能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生維持腫瘤干細胞特性[14]。

2.2 經(jīng)典上皮分子marker如E-cadherin的下調(diào)標(biāo)志著癌細胞發(fā)生emt，癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。而間質(zhì)樣細胞marker N-cadherin的上調(diào)預(yù)示著在胚胎發(fā)育炎、癥創(chuàng)傷修復(fù)以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移最終形成間質(zhì)樣細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化。常見的emt上皮分子markers還有ZO-1、β-Catenin、 Occludin 等。EMT 間質(zhì)分子 marker 也還有 Vimentin、Fibronectin、MMP2、MMP9、和 Twist、Snail、Slug、ZEB1、ZEB2 等轉(zhuǎn)錄因子[5]。發(fā)生emt后的腫瘤細胞，其分泌的MMP2和MMP9因子在癌癥浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著很重要的作用[16]。作為僅有的兩種明膠酶MMP2(明膠酶 A)和 MMP9(明膠酶 B)，其存在于腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)，以非活性酶原的形式(pro-MMP2 和 pro-MMP9)，水解切割抑制性區(qū)域后發(fā)揮其酶活性[17]。

3 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換分子調(diào)控機制

Emt的發(fā)生發(fā)展，以及相應(yīng)的分子調(diào)控機制非常的復(fù)雜，已報道調(diào)控emt的調(diào)控因子基本可分為非編碼RNA、生長和轉(zhuǎn)錄因子、信號通路和表觀修飾酶，這些因子形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)相互作用導(dǎo)致機體內(nèi)emt的產(chǎn)生。鑒于涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲這一特殊的臨床、生物學(xué)特性，相關(guān)研究表明生長因子(如神經(jīng)生長因子NGF、腦源性生長因子BDNF)在腫瘤細胞中上調(diào)，誘導(dǎo)發(fā)生emt，而這些神經(jīng)源性生長因子與涎腺腺樣囊性癌的嗜神經(jīng)侵襲特性密切相關(guān)[18-20]。目前大量研究發(fā)現(xiàn)各種轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Twist、ZEB1、ZEB2，通過不同方式抑制上皮分子 E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，增強腫瘤細胞的遷移能力，誘發(fā)EMT。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠促進腺樣囊性癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，對腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移起到了重要作用。而各種表觀轉(zhuǎn)移酶如組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去甲基酶等，在表觀遺傳學(xué)層面上通過對組蛋白進行修飾影響EMT的發(fā)生和進程。

4 非編碼RNA

近年來在現(xiàn)代生物學(xué)中，隨著基因組學(xué)的深入研究以及高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)遵循中心法則也就是DNA-mRNA-protein過程來編碼蛋白質(zhì)的基因組僅有約20000個[21]，約占所有基因組序列的1.5%，而一些基因組序列雖進行轉(zhuǎn)錄過程生成RNA卻不具有編碼蛋白的能力，卻在基因功能調(diào)控上起到作用[22,23]。我們稱這些轉(zhuǎn)錄后不能翻譯蛋白質(zhì)的RNA統(tǒng)稱為非編碼RNA(non-codingRNA) NcRNA， 包括短小非編碼RNA如miRNA、siRNA與長鏈非編碼RNA(long noncodingRNA) lncRNA,作為基因組中的暗物質(zhì)，這些非編碼序列，來源復(fù)雜[24-26]。具有類型多、作用模式復(fù)雜，數(shù)量較大等特點，在多層面發(fā)揮調(diào)控基因表達功能并在參與生命過程中起到重要作用[27]。在不同癌組織中呈現(xiàn)高或低不同表達趨勢與癌癥侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[28-30]。

4.1 非編碼微小miRNA(microRNA)簡介及調(diào)控機制

隨著mRNA和miRNA基因組分析、miRNA芯片檢測、qQT-PCR驗證和靶基因軟件預(yù)測及miRNA(microRNA)的研究深入，作為一類非編碼長度約18到25個核苷酸小分子單鏈RNA，其功能在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達，機體生長發(fā)育、新陳代謝、細胞增殖分化和凋亡發(fā)揮著重要作用。miRNA主要通過EMT的關(guān)鍵蛋白的mRNA 3’-UTR結(jié)合，靶向裂解mRNA或抑制該mRNA的翻譯，從而調(diào)控基因表達，最終影響EMT的進程[31]。目前已知miRNA調(diào)節(jié)多種信號分子及生物學(xué)信號通路，其表達與多種人類腫瘤相關(guān)。如miR-200 家族成員 (miR-200a、 miR-141、 miR-429、miR-200b、miR-200c)都能抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)基因ZEB1 和 ZEB2的表達，而基因 ZEB1和ZEB2則是誘導(dǎo) EMT發(fā)生的關(guān)鍵因子，miRNAs 與基因 ZEB1 和 ZEB2之間的負(fù)反饋調(diào)控也在癌癥轉(zhuǎn)移中有重要作用[32]。

4.2 長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA)lncRNA )

4.2.1長鏈非編碼RNA簡介 在非編碼RNA中，有一類存在于細胞質(zhì)或細胞核當(dāng)中轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,我們把這些缺少開放閱讀框不具備編碼蛋白質(zhì)能力的轉(zhuǎn)錄本成為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA)lncRNA。lncRNA具有三大顯著特征:其一，數(shù)量龐大功能多樣;其二，具有顯著的時空和組織特異性，常在細胞核中表達;其三，具有較高的可塑性，能夠?qū)Νh(huán)境變化迅速做出反應(yīng)。

4.2.2長鏈非編碼RNA調(diào)控機制 lncRNA在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、以及翻譯后修飾等多個層面上lncRNA調(diào)控基因的表達[31]。在表觀遺傳調(diào)控層面，lncRNA通過招募蛋白因子或調(diào)節(jié)基因表達的表觀遺傳復(fù)合物和染色質(zhì)相互作用，調(diào)控染色質(zhì)狀態(tài)，最終來對基因進行表達調(diào)控[32]，多種lncRNA如ANRIL、HOTAIR、KCNQ1OT1、HOTAIR、和 XIST均可以和沉默復(fù)合物PCR2結(jié)合，調(diào)控并影響emt進程[33-39]；其中一些lncRNA與染色質(zhì)沉默復(fù)合物結(jié)合后，對其進行系鏈重塑，并發(fā)揮支架作用，使多種發(fā)揮功能復(fù)合物通過lncRNA的鏈接形成一大型復(fù)合物，對相應(yīng)基因進行調(diào)控，也就是說lncRNA發(fā)揮了分子支架作用將不同的分子元件進行組裝以協(xié)同發(fā)揮調(diào)控作用[40]。其次，lncRNA作為轉(zhuǎn)錄因子誘餌能夠和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達，影響轉(zhuǎn)錄過程，而lncRNA則主要通過轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮其重要功能[41]；作為一種信號分子lncRNA可以感知和傳遞細胞內(nèi)外環(huán)境變化對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需求[42]。在轉(zhuǎn)錄水平，lncRNA可以作為招募因子作為轉(zhuǎn)錄因子的誘餌或轉(zhuǎn)錄的共調(diào)控子，引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子在特定基因簇上的富集或解離[43]。lncRNA還可以直接干擾RNA聚合酶的酶活性或作為增強子RNA(eRNA)來影響或調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[44]。最后，關(guān)于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控mRNA剪切、轉(zhuǎn)運和翻譯，及蛋白質(zhì)亞細胞定位等過程，lncRNA也起到重要作用，其主要通過影響mRNA穩(wěn)定性、mRNA翻譯以及影響mRNA剪接過程調(diào)控基因表達[45]，目前多種lncRNA發(fā)現(xiàn)在癌細胞中調(diào)控mRNA剪接、編輯和轉(zhuǎn)運。

4.3 microRNA 與長鏈非編碼 RNAs相互作用

lnc RNAs可以作為分子海綿 (sponges)，以競爭性內(nèi)源RNA (competing endogenous RNAs，ce RNA)的方式可以與某些miRNA特異性結(jié)合，影響miRNA發(fā)揮功能。這些lncRNA使得 mi RNAs 不能和其靶基因 3’-UTRs 結(jié)合，從而調(diào)控 mi RNAs 的靶基因的表達。如在頭頸部腫瘤的食管鱗狀細胞癌中，lncRNA MALAT1(肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1，metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)能夠與miR-101和miR-217結(jié)合并在轉(zhuǎn)錄后相互作用，調(diào)控腫瘤細胞增殖和遷移。而lncRNA ADAMTS9-AS2能夠與miR-143-3p結(jié)合，激活相關(guān)通路，發(fā)揮促進涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移。

5 miRNA在涎腺腺樣囊性癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中的相關(guān)調(diào)控

通過miRNA芯片檢測，靶基因軟件預(yù)測等生物信息學(xué)的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)大量miRNA(miR-24、miR23b、miR320等)及其靶基因與涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[46]，而這些miRNA在SACC癌及癌旁組織中呈現(xiàn)出明顯的差異性表達，抑制或促進SACC發(fā)展進程，進而影響SACC侵襲轉(zhuǎn)移，對其臨床分期及預(yù)后產(chǎn)生不同程度的影響。miR-24-3p在肺腺癌中能夠激活FGFR信號通路，參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，誘使癌癥轉(zhuǎn)移[47]。而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-24能夠影響SACC下?lián)艿那忠u轉(zhuǎn)移能力[48]，在SACC中miR-24是否通過emt途徑影響SACC還有待探討。miR-582-5p在SACC癌組織中呈現(xiàn)低表達趨勢與SACC的不良預(yù)后及高肺轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-582-5p的下調(diào)能夠激活轉(zhuǎn)錄因子FOXC1，而FOXC1反式激活snail，誘發(fā)emt，影響腫瘤細胞增殖促進癌癥的侵襲及轉(zhuǎn)移[49]。一種在多種腫瘤中高表達并且分布廣泛的非編碼微小RNA，miR-21，能夠促進腫瘤細胞增殖分化，抵御凋亡[50，51]。同樣miR-21在SACC對比癌旁組織在癌組織中表達上調(diào)，并能夠誘發(fā)emt，促進腫瘤細胞增殖分化增強其侵襲能力，促進SACC的發(fā)生發(fā)展[52]。辛伐他汀SIM ，一種HMG-CoA還原酶抑制劑，作為一種廣泛應(yīng)用的降脂類藥物能夠抑制部分腫瘤生長促進凋亡，從而促進化療敏感性，但大劑量的應(yīng)用能夠?qū)е录∪馑嵬礋o力等副作用[53]。而SIM聯(lián)合miR-21抑制劑能夠通過emt途徑協(xié)同抑制sacc細胞的侵襲和遷移[54]。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2，作為一種調(diào)控EMT途徑的重要的表觀修飾酶，miR-26a能夠在轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白水平下調(diào)EZH2，抑制涎腺腺樣囊性癌細胞的增殖活性[55]。這些miRNA相關(guān)機制的研究為臨床上SACC的多靶點治療及減少藥物耐性提供了新的思路。

6 lncRNA在涎腺腺樣囊性癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中的作用

lncRNA在腫瘤中不同方面發(fā)揮不同作用2011 年 Hanahan and Weinberg 在 cell 綜述上總結(jié)了癌癥的六大特征： 能夠無限增增殖、 抵抗細胞死亡、 誘發(fā)血管生成、細胞能夠永生化、 侵襲轉(zhuǎn)移能力增強和逃逸生長抑制[56]。大量現(xiàn)已報道的相關(guān)研究表明lncRNA與癌癥的六大基本特征有著密切的聯(lián)系，并且各種lncRNA能夠通過emt調(diào)控腫瘤進程。在頭頸部腫瘤中大量lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)如MALAT1,HOTAIR,MEG3，H19等。在口腔鱗癌中長鏈非編碼RNA,肺腺癌腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1,MALAT1，相較于癌旁組織其表達在癌組織中顯著增高[57]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MALAT1參與EMT介導(dǎo)腫瘤細胞侵襲遷移或增殖[58]。并且MALAT1能夠通過ATM-CHK2信號通路調(diào)控細胞周與凋亡[59]。HOX基因的反義基因間RNA,HOTAIR在多種惡性腫瘤組織中均有增高，在口腔鱗狀細胞癌組織中異常高表達[57-60]。而HOTAIR敲低后通過影響細胞周期促進凋亡，抑制細胞生長[61]。除此之外HOTAIR能夠招募EZH2，抑制E-cadherin表達，促進腫瘤發(fā)生EMT，增強腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。雖然HOTAIR及EZH2在SACC中具體分子調(diào)控機制未見報道，但有報道發(fā)現(xiàn)EZH2在涎腺腺樣囊性癌中，其癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。我們猜想HOTAIR在涎腺腺樣囊性癌中是否能夠同樣通過EMT途徑，促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，影響疾病預(yù)后。同樣在乳腺癌中長鏈非編碼RNAANCR能夠結(jié)合EZH2，招募CDK1，促進EZH1泛素化降解，通過emt途徑抑制乳腺癌細胞增殖，減弱其轉(zhuǎn)移侵襲能力，抑制癌癥進程[62]。而lncRNA ANCR是否能在SACC中發(fā)揮同樣功能，為我們提供了新的思路。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNAH19在口腔鱗狀細胞癌中呈現(xiàn)高表達，而miR138相較于H19其表達有所下調(diào)，具體機制研究表明LncRNAH19能夠抑制miR-138表達作為ceRNA，招募EZH2通過EMT途徑促進口腔鱗癌細胞的增殖，增強侵襲轉(zhuǎn)移能力。同樣H19是否通過EZH2調(diào)控SACC有待我們進一步的研究及探索。最新研究發(fā)現(xiàn)，通過分子雜交技術(shù)(ISH)的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA ADAMTS9-AS2在涎腺腺樣囊性癌組織及細胞中表達上調(diào)，通過qPCR、WB、CHIP、RIP、RNA pulldown、熒光素酶等試驗證實c-myc對其轉(zhuǎn)錄調(diào)，啟動ADAMTS9-AS2表達，并與miR-143-3p結(jié)合，競爭性抑制miR-143-3p的表達， 二者相互作用，調(diào)控下游靶基因ITGA6 表達，上調(diào)下游 PI3K/AKT和MEK/Erk 通路促進 SACC 侵襲和遷移。