付昱，李昕，韓冬，郭靖宇，王藝霖，張鴻

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110004）

ATP敏感性鉀通道（ATP-sensitive potassium channels，KATP）開放劑可以對腦缺血/再灌注損傷中的神經(jīng)元及血腦屏障相關(guān)蛋白發(fā)揮保護(hù)作用［1-2］，但對于小膠質(zhì)細(xì)胞的作用及相關(guān)信號通路仍不清楚。二氮嗪是一種線粒體KATP開放劑，研究［2］表明二氮嗪可以在大鼠腦缺血/再灌注模型中對神經(jīng)細(xì)胞及血腦屏障相關(guān)蛋白起保護(hù)作用。BV-2細(xì)胞是小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，常用作小膠質(zhì)細(xì)胞模型，用無糖血清和三氣培養(yǎng)箱創(chuàng)造氧糖剝奪條件對BV-2細(xì)胞進(jìn)行處理，可模擬缺血缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞微環(huán)境。本研究擬通過氧糖剝奪誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞探討二氮嗪對缺血缺氧狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

HERA Cell 150 三氣培養(yǎng)箱（美國 Billups-Rothenberg 公司），F(xiàn)ACScalibur流式細(xì)胞檢測分析儀（美國 BD 公司），Eclipse NI正置熒光顯微鏡+圖像采集系統(tǒng)（日本尼康公司 ），RPMI1640培養(yǎng)基、新生胎牛血清、無糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），AV/PI凋亡試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司），caspase-3抗體、FITC標(biāo)記二抗（美國Proteintech Group公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞用含有20%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)基1次。

1.2.2 分組建模及給藥：將4個培養(yǎng)皿的BV-2細(xì)胞傳代2 d后，分為A、B、C、D 4組。A組為對照組；B組更換為無糖無血清培養(yǎng)基并移至HERA Cell 150 三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行氧糖剝奪建模，持續(xù)充以10%CO2和90%N2，在此條件下培養(yǎng)6 h后復(fù)氧，更換為常氧、原培養(yǎng)液條件下再培養(yǎng)24 h；C組在氧糖剝奪處理之前給予二氮嗪100 μmol/L；D組在氧糖剝奪處理之前給予二氮嗪100 μmol/L+5-羥葵酸（5-hydroxydecanoate，5-HD）100 μmol/L。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測BV-2細(xì)胞的凋亡：用含0.25%EDTA的胰酶對BV-2細(xì)胞進(jìn)行消化處理，每樣本細(xì)胞數(shù)在1×105～5×105范圍內(nèi)，收集細(xì)胞后在高速冷凍離心機(jī)中以300g離心5 min，棄去上清培養(yǎng)液。加入PBS 500 μL洗滌2次，再以300g離心5 min。棄去上清培養(yǎng)液后，加入100 μL流式緩沖液進(jìn)行重懸，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，每管先加入5 μL AnnexinV-FITC，混勻后再加入2 μL PI工作液振蕩混勻，所有操作均在冰上進(jìn)行。于室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 免疫細(xì)胞熒光染色檢測cleaved caspase-3蛋白表達(dá)：待培養(yǎng)皿中的BV-2細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以104/孔鋪于6孔板，待細(xì)胞生長至鏡下視野的70%～80%，PBS洗3次，每次3 min。用4%多聚甲醛在-20 ℃固定20 min，PBS洗3次，每次3 min。5%BSA室溫封閉1 h。加入caspase-3一抗（稀釋1 ∶100），在濕盒中4 ℃過夜。PBS洗3次，每次3 min。加二抗（PBS稀釋1 ∶100），室溫避光孵育4 h，PBS洗3次，每次3 min。加入DAPI染色劑200 μL，室溫避光孵育5 min。PBS洗4次，每次5 min。加入50 μL抗熒光淬滅劑封片，利用熒光顯微鏡觀察蛋白定位并測定蛋白平均光密度值（IOD）。

1.2.5 免疫印跡實驗檢測cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況：收集BV-2細(xì)胞至EP管，用RIPA提取總蛋白，BCA蛋白定量，高溫變性。各組取40 g蛋白行10%SDS-PAGE凝膠電泳，110 V、86 mA恒壓轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5 %脫脂奶粉常溫封閉2 h。加入一抗（anti-cleaved caspase-3 稀釋1 ∶1 000及anti-β-actin 稀釋1 ∶5 000）4 ℃搖床過夜。加入二抗（1 ∶200與HRP2結(jié)合）孵育2 h，ECL染色，凝膠圖像分析儀掃描圖像，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度，計算目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組BV-2細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，B、C、D組凋亡率均有升高，與A組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；B、D組凋亡率升高較C組顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），B組和D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)情況

免疫熒光染色和免疫印跡檢測結(jié)果顯示，4組細(xì)胞內(nèi)均可見cleaved caspase-3蛋白表達(dá)。B、C、D組表達(dá)均高于A組，但C組低于B、D組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）），B組和D組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2～3。

3 討論

卒中是全球成人致死致殘的主要病因，隨著我國經(jīng)濟(jì)水平不斷提高，卒中已逐步成為我國僅次于心臟疾病和腫瘤的第三大致死病因。雖然對于卒中發(fā)生的分子和細(xì)胞機(jī)制的了解越來越深入，但是目前仍然沒有非常有效的治療藥物。

圖1 各組BV-2細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rate of BV-2 cells in different groups

圖2 各組BV-2細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)（免疫熒光染色）Fig.2 Expression of cleaved caspase-3 protein in different groups（immunafluorescence）

腦內(nèi)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、周細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞等組成神經(jīng)血管單元［3］。神經(jīng)血管單元中的小膠質(zhì)細(xì)胞作為“中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞”，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用一直為眾多學(xué)者所關(guān)注［4-6］，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血/再灌注損傷中的反應(yīng)，被作為一個重要的治療靶點加以研究［7-8］。前期研究［9-11］顯示，KATP開放劑吡那地爾能夠明顯減輕大鼠腦缺血/再灌注后的神經(jīng)功能損傷，減小梗死區(qū)體積，并通過激活PI3K/Akt/Bcl-2通路，影響神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，以此對腦組織起到保護(hù)作用。

多項研究［12-13］表明，KATP開放劑二氮嗪能夠降低病理條件下的神經(jīng)元PC12細(xì)胞的凋亡率。也有文獻(xiàn)［14］報道有藥物能夠減少氧糖剝奪后BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的釋放以及凋亡的發(fā)生，但KATP開放劑二氮嗪對氧糖剝奪后小膠質(zhì)細(xì)胞的作用仍不清楚。本研究使用流式細(xì)胞術(shù)和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二氮嗪可以減少氧糖剝奪/復(fù)氧后的BV-2細(xì)胞的凋亡。caspase-3蛋白是細(xì)胞凋亡的重要相關(guān)蛋白，通常被活化剪切為P17與P12 2種片段，引起凋亡發(fā)生［15-16］。本研究結(jié)果表明，二氮嗪能減少缺氧/復(fù)氧后BV-2細(xì)胞中caspase-3的活化，而5-HD作為一種KATP阻斷劑能降低二氮嗪對caspase-3的活化。證明KATP開放劑有可能是通過減少caspase-3蛋白的活化而發(fā)揮其對缺氧/復(fù)氧后的小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

圖3 各組cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平（Western blotting）Fig.3 Expression levels of cleaved caspase-3 protein in different groups（Western blotting）

綜上所述，本研究結(jié)果提示，KATP開放劑二氮嗪可能通過減少caspase-3的活化影響小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而對腦缺血/再灌注后的腦組織損傷發(fā)揮保護(hù)作用。但是，有關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞在病理條件下對神經(jīng)血管單元其他組成部分的作用以及KATP通道對腦缺血后神經(jīng)血管單元的影響，有待進(jìn)一步探討。