周博，趙興，付佳琳，郭曉臨

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.兒科，沈陽(yáng) 110001）

乳糜瀉（celiac disease，CD）是一種由于個(gè)體攜帶易感基因HLA-DQ（包括HLA-DQ2.2、HLA-DQ2.5和HLA-DQ2.8）而引起的麥麩物質(zhì)（主要是麩質(zhì)）敏感性腸病，該基因產(chǎn)物介導(dǎo)麩質(zhì)蛋白在小腸中誘發(fā)一系列自身免疫反應(yīng)，引起小腸黏膜損傷［1］。CD患者可表現(xiàn)出典型的吸收障礙癥狀和體征，也可表現(xiàn)出腸外非典型癥狀，如發(fā)育不良、骨質(zhì)疏松等［1］。小腸組織活檢發(fā)現(xiàn)典型病理變化即可診斷CD，但是由于小腸活檢屬于有創(chuàng)性檢查且難以實(shí)現(xiàn)，因此需應(yīng)用特異性血清抗體檢測(cè)進(jìn)行初步篩查，包括抗肌內(nèi)膜（endomysial antibody，EMA）抗體、抗組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase，tTG）抗體和抗麥膠蛋白（gliadin，GAF）抗體［2］。如果有條件，可同時(shí)進(jìn)行HLA-DQ2和HLA-DQ8基因分型檢測(cè)。若抗體與基因同時(shí)陽(yáng)性，即為CD疑似病例，建議行小腸活檢或隨訪［3］。CD確診后，最有效的治療方法是立即開(kāi)始無(wú)麩質(zhì)飲食，大多數(shù)患者都能夠通過(guò)無(wú)麩質(zhì)飲食改善臨床癥狀，修復(fù)損傷的小腸黏膜［4］。

CD曾被認(rèn)為發(fā)病主要集中在歐美人群［5］。該病對(duì)兒童的影響巨大，他們處在身體發(fā)育的關(guān)鍵階段，如果得不到及時(shí)的診斷和治療，生長(zhǎng)發(fā)育和心理健康都會(huì)受到嚴(yán)重影響，所以CD在歐美被定義為公共衛(wèi)生問(wèn)題［6］。我國(guó)在這方面的研究報(bào)道非常有限［7］，目前尚無(wú)關(guān)于兒童CD的系統(tǒng)性臨床研究。因此，本研究通過(guò)調(diào)查在具有1種或多種CD相關(guān)腸內(nèi)和腸外癥狀的兒童中易感基因及特異性自身抗體的檢出情況，分析其中的CD疑似病例，提示臨床應(yīng)完善CD相關(guān)檢查，提高對(duì)CD的重視。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

基因組DNA提取試劑盒（北京天根）；抗EMA抗體、抗tTG抗體、抗GAF抗體檢測(cè)試劑盒（ELISA法）；HLA-DQ2和HLA-DQ8核酸檢測(cè)試劑盒（微陣列法）、微陣列芯片自動(dòng)判讀儀（德國(guó)歐蒙）；System9700 PCR儀（美國(guó)ABI）。

1.2 研究對(duì)象

連續(xù)收集在2018年7月至9月間于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科門(mén)診就診的有CD腸內(nèi)及腸外癥狀［8］的兒童152例作為癥狀組，收集26例健康或無(wú)相關(guān)癥狀的兒童作為對(duì)照組。

1.3 方法

1.3.1HLA-DQ基因檢測(cè)：使用全血細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，要求濃度不低于20 ng/μL，260 nm/280 nm要求在1.6～1.8之間。將DNA用配套的PCR mix進(jìn)行目的片段（HLA-DQ2.2、HLA-DQ2.5及HLA-DQ8）擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系（5 μL DNA+20 μL PCR mix）。使用PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增：95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72℃ 20 s，37個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，8 ℃終止，之后將擴(kuò)增產(chǎn)物按說(shuō)明進(jìn)行微陣列基因芯片檢測(cè)，并使用芯片判讀儀進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.3.2 血清特異性自身抗體檢測(cè)：使用ELISA試劑對(duì)抗tTG抗體和抗GAF抗體進(jìn)行定量檢測(cè)，包括IgA和IgG。使用間接免疫熒光試劑對(duì)血清抗EMA抗體進(jìn)行定性檢測(cè)，應(yīng)用熒光顯微鏡進(jìn)行鏡下閱片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。癥狀組與對(duì)照組間易感基因及各類抗體檢出率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)＞5時(shí)，采用Pearson χ2檢驗(yàn)；當(dāng)期待頻數(shù)＜5時(shí)，采用Fisher確切概率分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-DQ基因的檢出情況

癥狀組152例患兒中共檢出44例基因陽(yáng)性，總檢出率為28.95%，其中以HLA-DQ2.2為主（16.45%）。4例患兒同時(shí)攜帶HLA-DQ2.2和HLA-DQ2.5，在計(jì)算攜帶2個(gè)等位基因的病例總數(shù)時(shí)，這4例患兒僅計(jì)1次，因此攜帶HLA-DQ2（HLA-DQ2.2+HLA-DQ2.5）的患兒總數(shù)為32例，HLA-DQ2的總檢出率為21.05%，高于HLA-DQ8（7.89%）。對(duì)照組26例兒童中各基因型的檢出情況與癥狀組相似。2組間各基因型的檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

2.2 血清特異性自身抗體的檢出情況

對(duì)癥狀組152例患兒的血清特異性自身抗體進(jìn)行檢測(cè)。抗EMA抗體的檢出率最高，為12.5%（19/152）。熒光顯微鏡下抗EMA抗體陽(yáng)性時(shí)，肝組織中可見(jiàn)肝血竇周?chē)啄こ霈F(xiàn)連續(xù)熒光，在高倍鏡下呈連續(xù)的線性熒光，為EMA沉積（圖1）?？箃TG抗體和抗GAF抗體的檢出率均為2.63%（4/152）。而在對(duì)照組中，3類抗體的檢出率均為0%。當(dāng)3類抗體同時(shí)檢測(cè)時(shí)，癥狀組抗體的總檢出率為17.76%（27/152），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015 8）。說(shuō)明CD相關(guān)癥狀的出現(xiàn)與患兒體內(nèi)存在的麩質(zhì)相關(guān)自身免疫反應(yīng)有關(guān)。

2.3 根據(jù)易感基因和抗體檢出情況分析CD疑似病例

癥狀組44例攜帶易感基因HLA-DQ2/HLADQ8的患兒中，共檢出7例抗體陽(yáng)性，抗體檢出率為15.9%（7/44）；未攜帶易感基因的108例患兒中，共檢出20例抗體陽(yáng)性，抗體檢出率為18.52%（20/108）；2組間抗體檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.817 2）。因此，攜帶易感基因未必引起CD相關(guān)的免疫反應(yīng)，還應(yīng)考慮兒童的飲食和生活習(xí)慣，以及家族遺傳史等因素。

表1 HLA-DQ2和HLA-DQ8檢出情況分析［n （%）］Tab.1 Detection rate of HLA-DQ2 and HLA-DQ8［n （%）］

圖1 熒光顯微鏡下抗EMA抗體陽(yáng)性的典型表現(xiàn)Fig.1 Typical patterns of anti-endomysium antibody positive cells under a fluorescence microscope

7例抗體與基因同時(shí)陽(yáng)性的患兒中，表現(xiàn)為不明原因腹痛3例，身材矮小2例，嘔吐和消化不良各1例，均為典型的CD相關(guān)癥狀，高度疑似CD（表2）。

表2 7例CD疑似病例臨床資料匯總Tab.2 Clinical information of the seven suspected celiac disease cases

3 討論

CD是與食物材料中含有的麩質(zhì)有關(guān)的一種特殊的紊亂狀態(tài)，通常與易感基因HLA-DQ2或HLADQ8相關(guān)，會(huì)形成一種特殊且隱匿的自身免疫反應(yīng)，造成隱窩增生、絨毛萎縮和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等小腸黏膜損傷，以及其他器官的功能損害［6］。1990至2009年間蘇格蘭兒童新發(fā)的CD病例數(shù)量增長(zhǎng)了6倍，一方面說(shuō)明隨著檢驗(yàn)技術(shù)和臨床認(rèn)識(shí)的進(jìn)步，越來(lái)越多的CD兒童得到了診斷，另一方面也表明，在兒童群體中可能存在著巨大的漏診率［9］。我國(guó)目前雖無(wú)系統(tǒng)的研究報(bào)道，但是CD散發(fā)病例報(bào)道逐漸增多，中國(guó)人群的基因和抗體攜帶率都高于預(yù)期［10］。CHOUNG等［5］通過(guò)對(duì)社區(qū)兒童進(jìn)行的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，1.1%的兒童可能患上CD而未能被診斷出來(lái)，其中10.8%在5年后都被確診為CD。目前在我國(guó)，CD尚未得到足夠的重視，針對(duì)兒童的調(diào)查研究更是稀有。

本研究從貼近臨床的角度，分析了在具有CD相關(guān)腸內(nèi)、腸外癥狀的兒童中，CD易感基因HLA-DQ2和HLA-DQ8的攜帶情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癥狀組與對(duì)照組易感基因檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍高于YUAN等［7］推測(cè)出的遼寧地區(qū)青年人群易感基因檢出率，這可能是由于本研究樣本量較為局限，無(wú)法進(jìn)行人群差異分析。若想更準(zhǔn)確地了解易感基因在本地區(qū)的攜帶情況，應(yīng)進(jìn)行大規(guī)模、多中心的流行病學(xué)調(diào)查研究。

在有癥狀患兒中，有17.76%的病例檢出自身抗體陽(yáng)性，且這個(gè)比例顯著高于對(duì)照組，因此可以確定，CD相關(guān)癥狀的出現(xiàn)與體內(nèi)存在CD相關(guān)的自身免疫反應(yīng)有關(guān)。將抗EMA抗體、抗tTG抗體和抗GAF抗體3類抗體聯(lián)合檢測(cè)，可有效分辨CD相關(guān)癥狀的出現(xiàn)與自身免疫反應(yīng)的相關(guān)性。因此，這種自身免疫反應(yīng)的存在應(yīng)該被視為CD的重要危險(xiǎn)因素之一，對(duì)此類患者應(yīng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及隨訪觀察。

目前篩查CD的重要手段，是對(duì)有相關(guān)癥狀的患者進(jìn)行特異性自身抗體檢測(cè)。抗體陽(yáng)性的患者，若同時(shí)攜帶易感基因，那么其患病風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)明顯增加。當(dāng)抗體濃度足夠高時(shí)，甚至不需要小腸組織活檢即可診斷CD［3］。由易感基因?qū)е碌腃D，通常是一個(gè)緩慢的過(guò)程，且受多種外界因素影響，如麩質(zhì)的攝入、母乳喂養(yǎng)方式或者腸道菌群改變等［11］。但是還有一些CD患者并不攜帶該基因，一項(xiàng)大型的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究結(jié)果顯示，IL-2、IL-22、CD80、CCR4等基因的改變也可能參與CD的形成［12-14］，這對(duì)傳統(tǒng)的CD診斷試圖依靠HLA-DQ基因檢測(cè)來(lái)陰性排除CD形成了挑戰(zhàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，在27例抗體陽(yáng)性的患兒中僅有7例同時(shí)檢出了CD基因，其余20例出現(xiàn)CD相關(guān)自身免疫反應(yīng)的病例原因無(wú)法確定，可能與這種情況有關(guān)。而據(jù)研究［15］報(bào)道，CD相關(guān)自身抗體陽(yáng)性特別是抗EMA抗體陽(yáng)性時(shí)，約有28%的病例可能進(jìn)展為CD，因此這種自身免疫反應(yīng)的存在應(yīng)該被視為CD的重要危險(xiǎn)因素之一，對(duì)此類患者應(yīng)持續(xù)關(guān)注。

CD患者一旦明確診斷，應(yīng)立即開(kāi)始無(wú)麩質(zhì)飲食，這能夠從根本上改善患者癥狀。對(duì)于抗體陽(yáng)性但不足以診斷為CD的患者，如果進(jìn)行無(wú)麩質(zhì)飲食，可緩解相關(guān)的癥狀，而如果任其發(fā)展，將有可能進(jìn)展為CD［16］。本研究檢測(cè)到的7例抗體與基因同時(shí)陽(yáng)性的患兒雖缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”小腸黏膜活檢的支持，但已能夠說(shuō)明這些患兒高度疑似CD，有必要進(jìn)行小腸活檢確診，或開(kāi)始無(wú)麩質(zhì)飲食進(jìn)行試驗(yàn)性治療。臨床醫(yī)生在面對(duì)具有CD典型癥狀且原因不明的臨床患者時(shí)，非常有必要將CD納入臨床診斷的考慮范圍內(nèi)，完善相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室診斷檢查。

綜上所述，CD易感基因HLA-DQ2和HLA-DQ8在有相關(guān)癥狀的兒童中有一定的檢出率，且其中有一定比例的兒童檢出CD特異性自身抗體陽(yáng)性，屬于CD疑似病例。建議對(duì)此類患兒完善相關(guān)檢查，盡早明確診斷并實(shí)施有效的治療，促進(jìn)兒童的健康成長(zhǎng)。