郭利晴，張慧予，李慧源，孫曉紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110032）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種起病隱匿，病程呈進(jìn)行性進(jìn)展的神經(jīng)退行性疾病，認(rèn)知障礙和行為損害是其主要特征，病理變化包括β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元變性［1］。近年來(lái)的研究［2］認(rèn)為腦內(nèi)促炎癥介質(zhì)的過度釋放加重了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有助于改善記憶和認(rèn)知能力。丁苯酞（butylphthalide，NBP）是一種廣泛用于治療腦血管疾病的藥物，在腦卒中模型中可以減少血腦屏障損傷，研究［3-4］發(fā)現(xiàn)NBP可以改善腦梗死的炎癥反應(yīng)，但是對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究擬利用Aβ25-35激活BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建AD炎癥細(xì)胞模型，并在給予NBP干預(yù)后檢測(cè)相關(guān)的炎癥和自噬指標(biāo)，探討NBP對(duì)炎癥的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心），胎牛血清（德國(guó)Sera Pro公司），細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/HIGH GLUCOSE（美國(guó)HyClone公司），純度＞99%的NBP粉末、純度＞99%的Aβ25-35（美國(guó)APExBIO公司），BCA蛋白定量試劑盒（中國(guó)萬(wàn)類生物科技公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司），ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司），LC3B和p62抗體（美國(guó)Proteintech公司），Beclin1、ATG5、白細(xì)胞介素（interlukin，IL）-6和IL-1β引物（武漢生工公司），實(shí)時(shí)PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），實(shí)時(shí)PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于含有90%DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基和10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d后進(jìn)行消化混懸，按1 ∶2或1 ∶3的比例傳代。將同時(shí)段培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為Control組（培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h）、Model組（20 μmol/L Aβ25-35處理細(xì)胞24 h）、NBP組（40 μmol/L NBP預(yù)處理2 h，20 μmol/L Aβ25-35繼續(xù)處理細(xì)胞24 h）和NBP聯(lián)合6-氨基-3-甲基嘌呤（3-methyladenine，3-MA）組（0.5 mmol/L 3-MA和40 μmol/L NBP依次預(yù)處理2 h，20 μmol/L Aβ25-35繼續(xù)處理細(xì)胞24 h）。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)NBP和Aβ25-35對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響：將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞混懸接種到96孔板，100 μL/孔，約5×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，對(duì)各組細(xì)胞分別進(jìn)行處理及培養(yǎng)后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 Western blotting：干預(yù)結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞3遍；提取總蛋白，BCA蛋白定量，行SDSPAGE電泳（濃縮膠80 V、30 min，分離膠110 V、60 min）；轉(zhuǎn)移蛋白至已被甲醇激活的聚二偏乙烯膜（80 V、90 min）；5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜（5 min/次×3次）；加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜（10 min/次×3次）；加入二抗孵育1 h，TBST洗膜（5 min/次×3次）；ECL發(fā)光顯色。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，應(yīng)用Image J軟件分析目的條帶和內(nèi)參β-actin的灰度值，用二者之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，用PCR試劑盒以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，GAPDH作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 ELISA：收集各組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)上清液中IL-1β的分泌量，450 nm讀板，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔IL-1β的含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NBP和Aβ25-35對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

利用CCK-8法檢測(cè)NBP和Aβ25-35對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞生存率的影響，將NBP濃度梯度依次設(shè)為0、10、20、40、60 μmol/L，Aβ25-35濃度梯度設(shè)為0、10、20、40 μmol/L。結(jié)果顯示，NBP濃度≤40 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取40 μmol/L作為干預(yù)細(xì)胞的終濃度；Aβ25-35濃度為10 μmol/L時(shí)細(xì)胞僅輕微受損，與未處理細(xì)胞相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，細(xì)胞損傷隨Aβ25-35濃度的增加而逐漸加重，故選擇20 μmol/L作為細(xì)胞造模的有效處理濃度。見圖1。

2.2 NBP對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞自噬效應(yīng)的調(diào)控

Western blotting和實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，與Model組相比，NBP組自噬蛋白LC3B-Ⅱ和自噬基因ATG5、Beclin1表達(dá)增加，p62蛋白表達(dá)減少，自噬水平上調(diào)。給予自噬抑制劑3-MA聯(lián)合處理后，3-MA組自噬水平較NBP組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 NBP對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用

Aβ25-35誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞后，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Model組炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6基因表達(dá)較Control組增加，ELISA結(jié)果顯示細(xì)胞上清液中IL-1β含量明顯升高。與Model組相比，NBP組IL-1β、IL-6mRNA和細(xì)胞上清液中IL-1β的表達(dá)顯著降低。3-MA組IL-1β、IL-6mRNA和細(xì)胞上清液中IL-1β水平較NBP組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖1 梯度濃度的NBP和Aβ25-35對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of concentration gradients of NBP and Aβ25-35on the viability of BV-2 microglial cells

圖2 Western blotting和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)自噬相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況Fig.2 Results of autophagy related indicators as detected by Western blotting and real-time PCR

3 討論

AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，慢性炎癥反應(yīng)是其眾多機(jī)制假說(shuō)中研究較為廣泛的一種。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，具有多種生物學(xué)功能，是介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞，生理狀態(tài)下呈靜息態(tài)，當(dāng)受到毒性物質(zhì)和病原體等病理因素刺激時(shí)，轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顟B(tài)。AD時(shí)具有神經(jīng)毒性的Aβ異常沉積，可招募小膠質(zhì)細(xì)胞遷移至其周圍而被激活，持續(xù)釋放促炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6等細(xì)胞毒性物質(zhì)，破壞周圍的神經(jīng)元和突觸，使其喪失正常的生理功能，逐漸進(jìn)展為中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥損傷［5-8］。小膠質(zhì)細(xì)胞及其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在AD的病理過程中具有重要作用。

自噬是細(xì)胞內(nèi)聚集蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器等病變的清除降解方式，在維持細(xì)胞生存、更新和宿主防御等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。自噬障礙與神經(jīng)退行性疾病、癌癥和代謝性疾病等多種病變的病理變化相關(guān)［9］。越來(lái)越多的證據(jù)表明自噬參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，自噬受損時(shí)炎癥反應(yīng)加重。研究［10-12］認(rèn)為，自噬可能通過清除聚集的炎性體，抑制其活化，進(jìn)而阻礙某些促炎癥介質(zhì)的釋放。因此，深入探討兩者之間的作用機(jī)制具有重要意義。

NBP是一種提取自芹菜的脂溶性物質(zhì)，具有抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、改善線粒體功能和增強(qiáng)認(rèn)知能力等多種神經(jīng)保護(hù)作用［13］。本研究利用NBP干預(yù)Aβ25-35構(gòu)建的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，通過Western blotting、ELISA和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞的炎癥指標(biāo)IL-1β、IL-6和自噬指標(biāo)ATG5、LC3B-Ⅱ、Beclin1及p62的變化，探究NBP與炎癥之間的作用機(jī)制。p62亦稱為sequestosome-1（SQSTM1），是一種自噬受體，介導(dǎo)泛素化底物的降解，自噬效應(yīng)增加時(shí)LC3B-Ⅰ脂化轉(zhuǎn)變成LC3B-Ⅱ并定位于自噬泡膜上，泛素化底物與p62特定區(qū)域結(jié)合后遷移至LC3B-Ⅱ位點(diǎn)，與之相互作用形成閉合的自噬體，自噬體吞噬p62及其介導(dǎo)的泛素化底物后與溶酶體融合，并在溶酶體酶的作用下降解清除p62和底物。自噬相關(guān)物質(zhì)ATG5和Beclin1的表達(dá)在自噬體形成過程中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用，是衡量自噬水平的重要指標(biāo)［14-16］。本研究結(jié)果顯示，Aβ25-35可以活化BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6表達(dá)增加，而NBP具有上調(diào)自噬、減輕炎癥反應(yīng)的作用，說(shuō)明自噬與炎癥之間確實(shí)存在某種聯(lián)系。為了驗(yàn)證這種關(guān)聯(lián)，本研究中設(shè)置了自噬抑制劑3-MA組，結(jié)果顯示，3-MA組在自噬水平受到抑制的同時(shí)，炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6表達(dá)增加。以上結(jié)果表明，NBP可能通過誘導(dǎo)自噬參與抗炎過程，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待深入探討研究。

圖3 ELISA和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)炎性相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果Fig.3 Results of inflammatory related indicators by ELISA and real-time PCR