張佳佳，張斌，袁瑩，高雪芹，郭敏，關(guān)一夫

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽 110122；2.附屬口腔醫(yī)院整形外科，沈陽 110002）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA［1］，介導(dǎo)mRNA降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤治療耐藥都有密切的關(guān)系［2］。研究［3-5］發(fā)現(xiàn)，miR-93-5p在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其過度表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性降低，從而發(fā)生耐藥。因此，推測可以通過檢測miR-93-5p反映化療過程中腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。如果檢測到miR-93-5p過量表達(dá)，則提示腫瘤細(xì)胞可能已經(jīng)對順鉑出現(xiàn)耐受，提醒醫(yī)生及時調(diào)整治療方案，對臨床患者的治療有積極意義。

滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）技術(shù)作為恒溫擴(kuò)增技術(shù)中的一種，建立于90年代中期［6］，該技術(shù)因其靈敏、特異、操作便捷的特點，已被應(yīng)用于環(huán)狀DNA擴(kuò)增、單核苷酸多態(tài)性、病原體及miRNA的檢測等多個方面［7-10］。本研究利用RCA技術(shù)建立了一種直接檢測miR-93-5p的方法，并以RT-qPCR方法作為對照對該方法進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用miR-93-5p由寶生物工程（大連）有限公司合成。E.coliDNA Ligase、Exonuclease Ⅲ、dNTP、RNAiso for Small RNA試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司，phi29 DNA Polymerase、SYBR GreenⅡ染 料、TaqManTMMicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqManTMUniversal Master MixⅡ（no UNG）、TaqManTMMicroRNA Assay試劑盒（含miR-93-5p特異性逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物、PCR擴(kuò)增引物、特異性TaqMan探針）均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。本研究中所用寡核苷酸均由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計：miR-93-5p序列信息來自miRBase（http：//www.mirbase.org/），Accession number為MIMAT0000093。利用DNAMAN和RNA structure軟件優(yōu)化寡核苷酸序列，使其自由能最低且無二級結(jié)構(gòu)。本研究所用寡核苷酸序列見表1。

表1 本研究所用寡核苷酸序列Tab.1 Oligonucleotide sequences used in the experiments

1.2.2 反應(yīng)原理：如圖1所示，首先，padlock probe的兩端與connection sequence堿基互補(bǔ)配對結(jié)合形成一個開鏈的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中padlock probe的3'-OH與5'-PO3緊密相鄰，在DNA ligase的作用下形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而成為一個閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。用exonuclease將閉合環(huán)上的connection sequence以及未成環(huán)的線性padlock probe、未結(jié)合的connection sequence酶切去除，進(jìn)而得到一個單鏈環(huán)狀DNA，利用此單鏈環(huán)狀DNA作為滾環(huán)擴(kuò)增的環(huán)形模板，待測miR-93-5p作為引物，在phi29 DNA polymerase的作用下進(jìn)行酶促延伸，產(chǎn)生大量與單鏈環(huán)狀模板互補(bǔ)的重復(fù)串聯(lián)拷貝序列，產(chǎn)物與SYBR Green Ⅱ熒光染料結(jié)合，在激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)出強(qiáng)熒光，通過酶標(biāo)儀收集熒光信號，從而達(dá)到檢測miR-93-5p的目的。

圖1 RCA檢測miR-93-5p的原理Fig.1 The principle of RCA detecting miR-93-5p

1.2.3 單鏈環(huán)狀模板的制備：連接反應(yīng)體系包含padlock probe（600 nmol/L）2 μL，connection sequence（600 nmol/L）2 μL，10×E.coliDNA Ligase Buffer 2 μL，E.coliDNA Ligase 60 U，去離子水補(bǔ)齊至20 μL；反應(yīng)條件為16 ℃連接16 h，65 ℃ 10 min終止反應(yīng)。制備環(huán)形模板的酶切反應(yīng)體系25 μL，連接產(chǎn)物20 μL，10×Exonuclease Ⅲ Buffer 2.5 μL，Exonuclease Ⅲ125 U，去離子水補(bǔ)齊至25 μL；反應(yīng)條件為37 ℃酶切16 h，95 ℃ 20 min終止反應(yīng)。

1.2.4 RCA反應(yīng)：體系包含10×phi29 DNA Polymerase Buffer 10 μL，dNTP 5 μL，100×SYBR GreenⅡ1 μL，phi29 DNA Polymerase 0.25 U，環(huán) 形 模 板（500 nmol/L）1 μL，miR-93-5p（濃度依不同實驗而定）1 μL，去離子水補(bǔ)齊至100 μL；反應(yīng)條件37 ℃ 30 min；酶標(biāo)儀實時掃描熒光值。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：制備引物池（RT Primer Pool）體系1 000 μL，包含5×RT primer10 μL，1×TE 990 μL；逆轉(zhuǎn)錄（參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書）體系15 μL，RT Primer Pool 6 μL，dNTPs with dTTP 0.3 μL，Multiscribe Reverse Transcriptase 3 μL，10×RT Buffer 1.5 μL，RNase Inhibitor 0.19 μL，Nuclease-free water 1.01 μL，待測miRNA 3 μL；反應(yīng)條件16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，58 ℃ 5 min，4 ℃終止反應(yīng)。產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存。

1.2.6 PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系20 μL，20×TaqMan MicroRNA Assays 1 μL，RT product 0.25 μL，TaqMan Universal Master MixⅡ（no UNG，2×）10 μL，去離子水8.75 μL。反應(yīng)條件95 ℃ 10 min；95 ℃10 s；40 ℃60 s，50個循環(huán)；37 ℃終止反應(yīng)。

1.2.7 實際樣品檢測：取貼壁培養(yǎng)的A2780細(xì)胞，用RNAiso for Small RNA試劑提取RNA，-80 ℃保存。分別用RCA及PCR 2種方法檢測miR-93-5p。

2 結(jié)果

2.1 padlock probe連接成環(huán)

padlock probe與connection sequence經(jīng)E.coliDNA Ligase連接后，一部分padlock probe形成了帶有connection sequence的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，一部分padlock probe形成了與connection sequence首尾相連的串聯(lián)長鏈結(jié)構(gòu)，還有一部分padlock probe和connection sequence處于游離狀態(tài)。為了得到單純的單鏈環(huán)狀DNA作為RCA的模板，用ExonucleaseⅢ處理連接產(chǎn)物，有效去除環(huán)狀結(jié)構(gòu)上的connection sequence、未成環(huán)的長鏈、游離的padlock probe和connection sequence，得到了單純的單鏈環(huán)狀DNA。理論上講，此時樣品中僅存閉合環(huán)狀的padlock probe。將不同處理條件的樣品加熱變性后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（16%）對其進(jìn)行了分析，電泳結(jié)果如圖2所示，經(jīng)連接反應(yīng)及酶切后，在60 bp處獲得1個清晰的條帶，這一條帶為單鏈環(huán)狀DNA，即single-stranded circular DNA。

圖2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（16%）分析padlock probe環(huán)化結(jié)果Fig.2 Polyacrylamide gel electrophoresis（16%）analyze results of padlock probe cyclization

2.2 靈敏度檢測結(jié)果

將人工合成的miR-93-5p作為標(biāo)準(zhǔn)品，制備一系列不同濃度的樣品，分別利用RCA方法和PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，用以評估RCA方法和PCR方法的檢測靈敏度。RCA方法檢測miR-93-5p的結(jié)果如圖3A和3B所示，檢測范圍為10～104pmol/L，當(dāng)miR-93-5p的濃度在250～1 000 pmol/L內(nèi)顯示了良好的線性關(guān)系，線性方程為y=862x-1974，R2=0.991 7。PCR方法檢測miR-93-5p的結(jié)果如圖3C和3D所示，檢測范圍為10～104pmol/L，線性方程為y=-5.68x+35.91，R2=0.999 8。結(jié)果顯示，RCA方法檢測miR-93-5p的靈敏度與PCR相近，但RCA方法線性檢測范圍較窄。

2.3 特異度檢測結(jié)果

圖3 RCA及PCR方法檢測miR-93-5p的靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Sensitivity of miR-93-5p and its standard curve as detected by RCA and PCR

本研究將miR-93-5p作為引物結(jié)合在環(huán)形模板上進(jìn)而引發(fā)擴(kuò)增，擴(kuò)增中可能會出現(xiàn)非檢測目的序列結(jié)合在環(huán)形模板上導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。為了確定這種檢測方法的特異度，選取了與miR-93-5p非同源且不相關(guān)的miRNA let-7家族中的let-7a～let-7f及與miR-93-5p只有1個堿基差異的RNA序列3'A-miR-93-5p來進(jìn)行特異度驗證。同樣是分別利用RCA方法和PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，用以評估RCA方法和PCR方法的檢測特異度。結(jié)果如圖4所示，RCA和PCR方法檢測miR-93-5p均顯示了良好的特異性。

2.4 實際樣品檢測

從貼壁培養(yǎng)的A2780細(xì)胞中提取RNA，然后對提取的RNA樣品分別進(jìn)行RCA和PCR檢測，擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示，RCA和PCR均能檢測出miR-93-5p，表明2種方法均可實現(xiàn)對樣品的檢測，適用于實際檢測。

3 討論

目前比較常用的miRNA檢測方法有Northern印跡法、微陣列芯片技術(shù)、實時PCR，但是這些方法均存在一定的缺點，如Northern印跡法和微陣列芯片技術(shù)對樣品需求量大、靈敏度低、特異性差、操作繁瑣，應(yīng)用時有諸多限制。在目前已經(jīng)發(fā)表的檢測miRNA的方法中，TaqMan探針stem-loop RT-qPCR方法是最經(jīng)典且靈敏度、特異度均較高的方法，可視為檢測miRNA方法中的金標(biāo)準(zhǔn)［11］。該方法雖然靈敏特異，但是價格昂貴，實驗條件要求較高，應(yīng)用范圍受到局限。恒溫擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)全程在同一溫度下進(jìn)行，對儀器要求大大簡化，反應(yīng)時間短，操作簡單，相比于以上幾種miRNA檢測方法更能滿足現(xiàn)代分子檢測技術(shù)“快速簡便”的要求，近年來逐漸應(yīng)用于miRNA的檢測。RCA是恒溫擴(kuò)增技術(shù)中的一種，模擬自然界中微生物環(huán)狀DNA的自我復(fù)制過程，以環(huán)狀單鏈DNA或RNA為模板，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下，引物沿著環(huán)形模板進(jìn)行擴(kuò)增，實現(xiàn)模板的信號放大。同樣檢測miRNA，PCR方法首先需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄cDNA后，才能進(jìn)行熱循環(huán)PCR擴(kuò)增檢出目的RNA，而本研究所建立的RCA方法則無需經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄和溫度變換，恒溫反應(yīng)僅需30 min即可直接檢出目的RNA，成本低廉，操作便捷，可實現(xiàn)樣本的快速檢測。

圖4 RCA及PCR檢測miR-93-5p特異性和點突變特異性Fig.4 Specificity of miR-93-5p and miR-93-5p point mutation as detected by RCA and PCR

圖5 RCA及PCR檢測A2780細(xì)胞中的miR-93-5pFig.5 miR-93-5p in A2780 cells detected by RCA and PCR

miR-93-5p作為一個與腫瘤調(diào)控相關(guān)的miRNA，與腫瘤耐藥有著密切的聯(lián)系［12］。在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，miR-93-5p過表達(dá)，檢測miR-93-5p可間接反映順鉑耐藥的情況，有助于疾病治療過程中及時發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥及調(diào)整治療方案，對臨床用藥有指導(dǎo)意義。本研究所建立的RCA方法可以方便快捷地檢測到不同濃度的miR-93-5p。但是，該方法在靈敏度方面還存在一定的局限，當(dāng)待檢測的miR-93-5p達(dá)到特定濃度時，曲線上升極快，線性度較差，這也是恒溫擴(kuò)增方法普遍存在的問題［13］。本研究的關(guān)鍵問題之一在于DNA與miRNA的雜交效率，不同濃度雜交效率的不同導(dǎo)致實際RCA反應(yīng)時線性范圍較窄。同時恒溫擴(kuò)增普遍還存在的一個問題就是沒有理想的質(zhì)控指標(biāo)［14］，這些都有待于進(jìn)一步探究。

總之，本研究所建立的檢測miR-93-5p的RCA方法所需設(shè)備簡單，操作快捷，易于推廣應(yīng)用，具有較高的實際應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。