黃 晨, 蔣霞敏, 韓慶喜, 彭瑞冰, 周爽男

新月菱形藻()制備參數(shù)對藻球性質(zhì)及去氮磷效果的影響

黃 晨, 蔣霞敏*, 韓慶喜, 彭瑞冰, 周爽男

（寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315832）

為了制備出高效的固定化藻球, 完善固定化藻球的制備工藝, 以新月菱形藻為藻種, 采用褐藻膠包埋技術(shù)和單因子試驗, 研究了不同褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.0％、2.5％、3.0％)和不同溶劑(海水、蒸餾水、NaCl溶液)對藻球形狀、強(qiáng)度、傳質(zhì)性、去除氮磷效果及藻細(xì)胞生長的影響. 結(jié)果表明: 不同褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對藻球形狀影響顯著(<0.05), 褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0％和2.5％時藻球呈球形, 為3.0％時藻球呈不規(guī)則的水滴形; 不同溶劑種類對藻球形狀則無影響. 不同褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對藻球強(qiáng)度影響顯著(<0.05), 隨著褐藻酸鈉濃度的增加, 藻球強(qiáng)度逐漸增強(qiáng); 不同溶劑對藻球強(qiáng)度的影響顯著(<0.05), 影響大小的排序為海水>NaCl>蒸餾水. 不同褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和不同溶劑對藻球傳質(zhì)性影響顯著(<0.05), 隨著褐藻酸鈉濃度的增加, 藻球傳質(zhì)性也逐漸增強(qiáng); 溶劑對傳質(zhì)性影響的強(qiáng)弱排序為海水>NaCl>蒸餾水; 不同褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和不同溶劑對固定化藻球藻細(xì)胞生長及去氮磷效率影響顯著(<0.05), 其中以3.0％褐藻酸鈉+海水的藻細(xì)胞生長最快, 去除氮磷效率最佳.

褐藻酸鈉濃度; 溶劑種類; 固定化新月菱形藻; 藻球性狀; 生長速率; 氮磷去除效率

固定微藻的方法主要有3種: 包埋法、交聯(lián)法和載體結(jié)合法[1], 目前研究最多的是包埋法. 微藻固定化包埋技術(shù)是指將游離的微藻細(xì)胞通過固定和包埋等方法將游離的微藻細(xì)胞固定在載體上的方法[2], 其原理是讓藻細(xì)胞擴(kuò)散, 進(jìn)入到多孔性載體的內(nèi)部, 或利用高聚物等在形成凝膠時將藻細(xì)胞包埋在內(nèi)部[3]. 包埋法的優(yōu)點是在固定化過程中藻細(xì)胞活性喪失少, 固定化藻球的強(qiáng)度高、傳質(zhì)性能較好、性質(zhì)較穩(wěn)定等[4-6]. 固定化技術(shù)使藻細(xì)胞不僅有溫和的環(huán)境, 且不易受外界的影響, 藻群較易控制, 能反復(fù)的使用, 在一定程度上可提高利用率; 同時具有較高的藻細(xì)胞濃度, 反應(yīng)速度快. 另外, 藻類的固定化有利于固液分離, 便于藻的收獲和綜合利用[7-8]. 目前國內(nèi)外研究較多的是淡水固定化微藻, 有關(guān)海水固定化微藻鮮有報道[9-10].

新月菱形藻()隸屬硅藻門、羽紋硅藻綱、管殼縫目、菱形藻科、菱形藻屬, 是常用的單細(xì)胞餌料種, 具有生長繁殖快、易培養(yǎng)等優(yōu)點. 本文以新月菱形藻為藻種, 褐藻酸鈉為固定化載體, 分別以蒸餾水、海水和NaCl溶液為溶劑, 探究不同濃度褐藻酸鈉和不同溶劑對藻球形狀、藻球強(qiáng)度、藻球傳質(zhì)性、藻細(xì)胞生長及其去除氮磷的影響, 旨在為微藻固定化培養(yǎng)與養(yǎng)殖污水的治理提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的新月菱形藻來自寧波大學(xué)海洋學(xué)院藻種室. 培養(yǎng)液配方采用寧波大學(xué)3#培養(yǎng)液(表1). 培養(yǎng)用水采用象山港天然海水, 經(jīng)沙濾、暗沉淀、脫脂棉過濾和燒開冷卻. 將藻種置于GXZ智能型光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)培養(yǎng), 培養(yǎng)條件: 溫度(25±1)℃, 鹽度25, 光照強(qiáng)度4500lx, pH 7.86, 光暗周期L:D(12h:12h), 不充氣. 實驗采用人工模擬污水, 即在缺氮的3#母液中加入一定量的NH4Cl (NH4+-N質(zhì)量濃度為17mg·L-1).

表1 寧波大學(xué)3#培養(yǎng)液配方

脫固定化方法: 在測定固定化藻細(xì)胞密度時先脫固定化, 即將固定化藻球放入盛有一定量3.0％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)化解液中, 搖動, 直至固定化藻球完全溶解成懸浮狀, 再測定藻細(xì)胞密度.

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 固定化藻球制作方法

藻的固定化采用褐藻酸鈉包埋, 即將處于對數(shù)生長期的蛋白核新月菱形藻液置于立式高速離心機(jī)(ELITIST 15K), 以3000r·min-1離心10min, 棄上清液, 用少許消毒海水溶解備用. 采用不同溶劑(海水、蒸餾水、NaCl溶液)和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(4.0％、5.0％和6.0％)的褐藻酸鈉, 攪拌制成均一的凝膠, 在干熱滅菌鍋(YX-280B)中120℃高壓滅菌1h, 冷卻至室溫((25±3)℃). 將褐藻酸鈉與濃縮藻液按體積(1:1)混合, 攪拌制成均一的褐藻酸鈉藻膠. 用制粒機(jī)在距離3.0％CaCl2溶液液面5cm處, 制成直徑約3mm的藻球, 固定2h, 用不同褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.0％、2.5％、3.0％)和不同溶劑(海水、蒸餾水、NaCl溶液)制備藻球.

1.2.2 不同藻球的形狀、強(qiáng)度及傳質(zhì)性試驗

將制成的9種不同的固定化藻球, 分別用顯微鏡、質(zhì)構(gòu)儀(TMS-PRO)和分光光度計(UV2800AH)進(jìn)行分析.

1.2.3 不同藻球?qū)υ迳L及去氮磷效果試驗

將制成的9種固定化藻球用250mL三角燒瓶培養(yǎng), 加入人工模擬廢水200mL, 加藻球5g, 每組設(shè)3個平行, 并設(shè)不加藻球的空白組. 培養(yǎng)條件同1.1節(jié), 培養(yǎng)時間9d, 隔天測定水體中NH4+-N和PO43--P濃度. 始末用血球計數(shù)板法對藻細(xì)胞計數(shù).

1.3 測定指標(biāo)

藻球形狀測定: 采用顯微鏡法, 用鑷子取出制備的試驗藻球, 置于吸水紙上, 除去多余的水分, 用美工刀將藻球?qū)η谐蓛砂? 橫切面向上置于載玻片上, 蓋上蓋玻片, 在40倍顯微鏡下觀察, 并拍照記錄.

藻球強(qiáng)度測定: 采用質(zhì)構(gòu)儀的測試方法, 每組樣品用鑷子取出5~10顆藻球, 置于吸水紙上, 除去水分; 再夾取1顆藻球置于測試臺面中心, 啟動測定按鈕, 讀取數(shù)據(jù). 每個樣品測試3次.

藻球傳質(zhì)性測定: 將分光光度計的波長調(diào)至600nm, 取0.2mL的藍(lán)墨水加入比色皿中, 再加入50mL純水進(jìn)行稀釋并搖勻. 分別取不同藻球(9 種)各4g, 浸泡時間3 min, 從各比色皿中依次吸取5mL墨水, 加入20mL純水稀釋, 用未放膠球的對照組依次潤洗比色皿2次, 測量并記錄數(shù)據(jù).

生長速率測定: 始末取20mL3.0％的Na3C6H5O7溶液加入離心管中, 再在各試驗組中取1g藻球加入離心管, 溶解2~3h, 攪拌, 用血球計數(shù)板法計數(shù), 藻細(xì)胞生長速率的計算公式為:

=(ln1-ln0)/(1-0),

式中:0為培養(yǎng)開始時間;1為培養(yǎng)結(jié)束時間;0、1分別為0、1時期的藻細(xì)胞密度.

NH4+-N和PO43--P測定: 用納氏試劑分光光度法測NH4+-N, 用磷鉬藍(lán)分光光度法測PO43--P[7]. 氮磷去除率的計算公式為:

=(0–1)/0,

式中:0為初始氮磷濃度;1為第天的氮磷濃度.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行處理數(shù)據(jù), 并用SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan和單因素的方差分析, 以及多重比較分析, 以<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的褐藻酸鈉與不同溶劑對藻球形狀的影響

不同濃度的褐藻酸鈉與不同溶劑對藻球形狀的影響顯著. 當(dāng)褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0％時, 3種溶劑制成的藻球均呈球形; 當(dāng)褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5％時, 海水和2.0％NaCl制成的藻球呈球形, 蒸餾水制成的藻球呈亞梨形; 而當(dāng)褐藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0％時, 3種溶劑制成的藻球均呈不規(guī)則的水滴形(圖1).

1為2.0％褐藻酸鈉+蒸餾水; 2為2.0％褐藻酸鈉+海水; 3為2.0％褐藻酸鈉+NaCl; 4為2.5％褐藻酸鈉+蒸餾水; 5為2.5％褐藻酸鈉+海水; 6為2.5％褐藻酸鈉+NaCl; 7為3.0％褐藻酸鈉+蒸餾水; 8為3.0％褐藻酸鈉+海水; 9為3.0％褐藻酸鈉+NaCl. 下圖同.

2.2 不同濃度的褐藻酸鈉與不同溶劑對藻球強(qiáng)度的影響

不同濃度的褐藻酸鈉與不同溶劑對藻球強(qiáng)度的影響如圖2所示.

從圖2可知, 實驗?zāi)┢诘脑迩驈?qiáng)度均小于實驗初期的強(qiáng)度(<0.05); 實驗證明不同褐藻酸鈉濃度對藻球強(qiáng)度的影響顯著(<0.05), 固定化強(qiáng)度隨著褐藻酸鈉濃度的增大而增強(qiáng), 藻球強(qiáng)度大小排序為3.0％褐藻酸鈉>2.5％褐藻酸鈉>2.0％褐藻酸鈉; 不同溶劑對藻球強(qiáng)度的影響顯著(<0.05), 藻球強(qiáng)度按大小排序為海水>NaCl>蒸餾水. 在實驗組中強(qiáng)度最大的是3.0％褐藻酸鈉+海水組, 在實驗初期和末期強(qiáng)度分別為185g和151g.

2.3 不同濃度的褐藻酸鈉與不同溶劑對藻球傳質(zhì)性的影響

不同濃度的褐藻酸鈉與不同溶劑對藻球傳質(zhì)性影響顯著(圖3). 在前3min, 吸光度的降速遠(yuǎn)大于后6min; 不同褐藻酸鈉濃度對藻球傳質(zhì)性也有顯著影響(0.05), 其中傳質(zhì)性最好的是3.0％褐藻酸鈉濃度組, 平均為31.33％; 2.0％和2.5％褐藻酸鈉組傳質(zhì)性較差, 兩者不存在顯著性差異(0.05). 不同的溶劑對藻球傳質(zhì)性影響顯著(0.05), 其中傳質(zhì)性最好的是海水組, 平均為35.33％; 傳質(zhì)性較差的為蒸餾水和NaCl組, 兩者不存在顯著性差異(0.05); 實驗中傳質(zhì)性較好的是3.0％褐藻酸鈉+海水組和3.0％褐藻酸鈉+蒸餾水組, 吸光度分別為30％和31％, 與其他組存在顯著性差異(0.05); 傳質(zhì)性最差的是2.5％海藻酸鈉+NaCl組, 吸光度為44％, 與其他組存在顯著性差異(0.05). 從傳質(zhì)性角度分析, 效果好的組可在單位時間內(nèi)吸收更多的營養(yǎng)素和較少的水分.

2.4 不同濃度的褐藻酸鈉與不同溶劑對藻球生長的影響

不同褐藻酸鈉濃度和不同溶劑對藻球生長的影響如圖4所示. 實驗組值在0.2635~0.4457之間; 不同的褐藻酸鈉濃度對藻球生長影響顯著(0.05), 2.0％、2.5％和3.0％褐藻酸鈉組的值分別為0.3066、0.3333和0.3645. 不同溶劑對藻球生長影響顯著(0.05), 其中生長最好的是海水組,值為0.3467; 蒸餾水和NaCl組,值分別為0.3254和0.3216, 兩者不存在顯著性差異(0.05). 在實驗組中生長最好的是3.0％褐藻酸鈉+海水組,值為0.4457, 與其他組存在顯著性差異(0.05); 傳質(zhì)性最差的是2.0％海藻酸鈉+海水組,值為0.2635, 與其他組存在顯著性差異(0.05). 從生長角度分析, 效果好的組可在單位時間內(nèi)獲得更高的生長速度.

2.5 不同的褐藻酸鈉濃度和不同溶劑對藻球氮磷去除的影響

不同的褐藻酸鈉濃度和不同溶劑對藻球去氮磷的影響如圖5和圖6所示. 實驗組9d中NH4+-N去除率為67.82％~90.61％, PO43--P的去除率為49.02％~96.68％. 不同褐藻酸鈉濃度對藻球NH4+-N去除影響顯著(0.05), 2.0％、2.5％和3.0％褐藻酸鈉組對NH4+-N去除率分別為78.42％、81.71％和88.76％. 不同溶劑對藻球NH4+-N去除率影響顯著(0.05), 其中NH4+-N去除率最好的是海水組, 去除率為89.82％; 蒸餾水和NaCl組較差, NH4+-N去除率分別為80.92％和78.16％, 且兩者不存在顯著性差異(0.05); 實驗組中NH4+-N去除率最好的是3.0％褐藻酸鈉+海水組, 去除率為90.61％, 與其他組存在顯著性差異(0.05); 最差的是2.0％褐藻酸鈉+NaCl組, 去除率為67.82％, 與其他組存在顯著性差異(0.05). 不同溶劑對藻球PO43--P去除影響顯著(0.05), 其中蒸餾水組、海水組和NaCl組PO43--P去除率分別為77.59％、88.57％和69.23％, 最佳的溶劑為海水; 不同褐藻酸鈉濃度對藻球PO43--P去除率影響顯著(0.05), 其中去除效果最好的是3.0％褐藻酸鈉組, 去除率為84.85％; 最差的為2.0％褐藻酸鈉組, 去除率為68.83％. 在實驗組中PO43--P去除率最好的是3.0％褐藻酸鈉+海水組, 去除率為96.68％, 與其他組存在顯著性差異(0.05); PO43--P去除率最差的是2.0％褐藻酸鈉+NaCl組, 去除率為49.02％, 與其他組存在顯著性差異(0.05).

3 討論

3.1 不同的固定化藻球制作方法對藻球外部的影響

固定化藻球需具有較高的粒度、強(qiáng)度和孔隙度等, 否則藻細(xì)胞容易脫落, 同時載體必須利于物質(zhì)交換, 便于藻對營養(yǎng)鹽和CO2的吸收[11-12]. Eroglu等[13]研究了不同來源的褐藻酸鈉鹽作為細(xì)胞固定化基質(zhì)的性質(zhì), 發(fā)現(xiàn)褐藻酸鹽的黏度與其分子量成正比, 褐藻酸鈉濃度影響膠球的機(jī)械強(qiáng)度, 當(dāng)濃度大于一定值時, 主要受濃度影響. 在本研究所制成的不同濃度褐藻酸鈉藻球, 不僅導(dǎo)致制成的藻球的黏度有差別, 而且導(dǎo)致藻球形狀差別很大, 2.0％褐藻酸鈉都為規(guī)則的球形, 而3.0％褐藻酸鈉則為水滴形. 這是由于在成球過程中, 褐藻酸鈉中Na+與固定液Ca2+置換造成. 海水和2.0％NaCl中含有游離Na+離子, 會增大成球的黏性.

3.2 不同固定化藻球制作方法對藻球內(nèi)部的影響

隨著褐藻酸鈉濃度的增加, 其與CaCl2溶液所形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)逐漸致密, 凝膠珠的機(jī)械強(qiáng)度增高, 藻細(xì)胞能夠很好地包埋于其中, 并通過凝膠網(wǎng)格的孔隙獲得培養(yǎng)液中的營養(yǎng), 排除代謝物[14-15]. 這與本實驗結(jié)果(最高的褐藻酸鈉組(濃度為3.0％)具有最高的強(qiáng)度、最好的傳質(zhì)性、最大的生長速率和最高的氮磷去除率)相符. 在實驗進(jìn)行到第9天時2.0％褐藻酸鈉組有部分藻球出現(xiàn)水解破碎, 這是由于形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)不夠堅固, 在交換營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物時易被水流沖碎, 而2.5％和3.0％的褐藻酸鈉組均未出現(xiàn)上述情況, 這與楊海波等[16]選用2.0％褐藻酸鈉研究結(jié)果不一致, 其原因有待進(jìn)一步研究. 在3種溶劑的比較中, 海水的效果最好, 因為相較于蒸餾水, 海水中含有大量的Na+離子, 在與CaCl2溶液交聯(lián)過程中提高了凝膠中Na+離子的濃度, 從而提高了交聯(lián)效果[17]; 同時, 相較于NaCl溶液, 海水中含有少量的Mg2+、K+、Sr2+等離子, 可能會對凝膠網(wǎng)絡(luò)有加固作用, 這與Wahid 等[18]在用多層石墨烯和氧化石墨烯板片固定化新月菱形藻的研究結(jié)果相一致.

3.3 不同固定化藻球制作方法對藻球生長的影響

本實驗采用包埋法對新月菱形藻進(jìn)行固定化處理, 各組都有很高的生長率, 與邢麗珍等[11-12]研究結(jié)果相一致. 3.0％褐藻酸鈉組雖具有較高的生長率, 但在實驗結(jié)束1個月后發(fā)現(xiàn)其最先發(fā)黃衰敗, 這和楊海波等[16]的研究結(jié)果相一致. 因此, 固定化藻球的長時間使用有待進(jìn)一步研究.

3.4 不同固定化藻球制作方法對藻球氮磷去除的影響

微藻對水體氮的去除, 主要是通過吸收無機(jī)和有機(jī)氮化合物作為氮源來合成氨基酸, 其中對無機(jī)氮的利用以NH4+-N為主, 這是由于藻類缺乏活性硝酸還原酶, 因此微藻對硝氮NO3--N的吸收利用. 僅發(fā)生于NH4+-N濃度很低或耗盡時[19]. 藻類對污染水體中磷的去除, 包括藻類對磷的吸收以及對含磷化合物的表面吸附沉積, 其中主要是利用活性磷酸鹽來維持藻類的生長[20-21]. 此外, 藻類生長繁殖會導(dǎo)致水體pH值的增加, 會將氨氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘睔忉尫? 也會使溶解性磷酸鹽與水中的鈣離子形成羥基化磷酸鈣物質(zhì)沉淀, 最后被藻類所吸附[22]. 在本實驗中, 由于3.0％褐藻酸鈉組具有更高的生長率, 因此具有最高的氮磷去除率, 這與文獻(xiàn)[23-25]的研究結(jié)果相一致, 但與文獻(xiàn)[26]的研究結(jié)果相悖, 其原因可能與不同微藻種類以及不同藻球的制備環(huán)境有關(guān).

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Effects of preparation parameters ofon algae ball properties and removal efficiency of NH4+-N/PO43--P

HUANG Chen, JIANG Xiamin*, HAN Qingxi, PENG Ruibing, ZHOU Shuangnan

( School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China )

The current study is aimed to prepare a highly efficient immobilized algae ball and improve its preparation process.is an algae species. Alginate embedding technique was used in the experiments. The effects of different sodium alginate concentrations (2.0％, 2.5％, 3.0％) and different solvents (seawater, distilled water, NaCl solution) on the shape, strength, mass transfer, as well as nitrogen and phosphorus removal of algae were examined, with the effects of algal cell growth also studied. The results showed that different sodium alginate concentrations produced significant effects on the shape of algae spheres (0.05). When the concentration of sodium alginate was either 2.0％or 2.5％, the algae spheres were spherical. In contrast, the algae spheres were irregular at a sodium alginate concentration of 3.0％. Solvent types failed to significantly alter the shape of the algae sphere. The concentration of sodium alginate produced a significant effect on the strength of the algae sphere (<0.05). With the increased concentration of sodium alginate, the strength of the algae sphere also increased. The effect of solvent on the strength of algae was significant (0.05). The strength of algae was sorted by size: seawater>NaCl>distilled water. There was a significant effect of the mass transfer of algae, the concentrations of sodium alginate and solvents (<0.05). As the concentration of sodium alginate increased, the mass transfer of algae gradually increased. In the presence of solvent, mass transfer was evident. The performance was seawater>NaCl>distilled water. The growth of immobilized algae cells was significantly affected by concentrations of sodium alginate and solvents (0.05). Algae cells with 3.0％ sodium alginate+seawater showed the fastest growth speed and the denitrifying phosphorus with 3.0％ sodium alginate+seawater showed the greatest efficiency.

concentration of sodium alginate; solvent species; immobilized; algal globular traits; growth rate; ammonia nitrogen and orthophosphate removal efficiency

S917.1

A

1001-5132（2020）01-0032-06

2019?08?11.

寧波大學(xué)學(xué)報（理工版）網(wǎng)址: http://journallg.nbu.edu.cn/

浙江省公益項目（2015C3204）; 寧波市科技項目（2015C10062）; 溫州市科技計劃項目（2018ZS002）.

黃晨（1996－）, 男, 浙江寧波人, 在讀碩士研究生, 主要研究方向: 微藻定向培養(yǎng). E-mail: 2074207292@qq.com

蔣霞敏（1957－）, 女, 浙江舟山人, 博導(dǎo)/教授, 主要研究方向: 水產(chǎn)養(yǎng)殖與餌料生物培養(yǎng). E-mail: jiangxiamin@nbu.edu.cn

（責(zé)任編輯 史小麗）