劉媛媛，陳媛媛，張紅艷，尤金坤，魏小紅，余宇燕

(福建中醫(yī)藥大學 藥學院，福建 福州 350122)

中藥材因其獨特的療效和天然活性被廣泛用于藥物制劑、保健品、食品等領域。然而，一些藥農為提高中藥材的產量和利潤，過度使用農藥，使其在藥材中殘留成為安全隱患[1-3]。有機磷農藥是指含磷元素的有機化合物農藥，是一種神經毒物，主要用于防治植物病、蟲、草害，廣泛用于農業(yè)生產[4-5]，但在農作物中會發(fā)生不同程度的殘留。有機磷農藥會使乙酰膽堿酯酶失活造成中樞神經系統(tǒng)紊亂，表現出震顫、出汗、精神錯亂、語言失常等一系列神經中毒癥狀，嚴重者會出現呼吸麻痹，甚至危及生命[6-9]。

圖1 納米金可視化檢測原理圖Fig.1 Nano gold visual inspection schematic

傳統(tǒng)的有機磷殘留檢測方法多為色譜法[10]，雖然可進行多成分同時檢測、準確度高，但其儀器較昂貴，預處理繁瑣、耗時長，對儀器和操作人員要求較高[11-12]。目前，農藥有機磷殘留的常用快速檢測方法有酶抑制法和免疫分析法[13]。酶抑制法主要利用有機磷農藥的特性來抑制乙酰膽堿酯酶的活性，雖然檢測成本低、易于操作[14-15]，但酶易失活不穩(wěn)定，導致檢測結果的誤差較大。免疫分析法雖特異性強，但抗體制備周期長、成本高[16]，實際應用困難。

本研究選取可與有機磷農藥特異性結合的適配體[17]作為識別元件，建立了甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷、水胺硫磷4種有機磷農藥的快速檢測技術，正常條件下，體系中檸檬酸根離子附著金納米粒子表面可形成靜電保護層，使納米金顆粒均勻分散在體系中形成穩(wěn)定的膠體溶液。在高鹽環(huán)境下納米金發(fā)生聚集，從而產生顏色和吸收光譜的變化；若在體系中加入適配體，金納米粒子與適配體通過靜電吸附作用結合，適配體可以保護金納米粒子在溶液中保持分散狀態(tài)，免受鹽的誘導，體系顏色不變；再加入待測靶標后，核酸適配體與納米金表面解離，并與靶標結合，金納米粒子失去保護，在高鹽濃度下聚集，溶液的顏色由紅色變藍紫色，顏色的變化程度與添加目標物的濃度呈正相關，其檢測機理見圖1。通過表征金納米粒子體系顏色變化，可實現對藥材中4種有機磷農藥(甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷、水胺硫磷)的可視化檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Infinite M200 PRO多功能酶標儀(Tecan儀器公司)；KQ116型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FiveEasy Plus型精密pH計、ME204E電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；渦旋儀(Kylin-Bell Lab儀器公司)。

氯金酸(HAuCl4·4H2O，國藥化學試劑有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸三鈉、三羥甲基氨基甲烷(上海化學試劑總廠)；氯化鈉、濃硝酸、濃鹽酸、甲醇、氯化鉀、二甲基甲酰胺、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(國藥化學試劑有限公司)；以上試劑均為分析純，實驗用水為超純水。甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷、水胺硫磷、樂果標準品(阿拉丁有限公司)；馬拉硫磷、辛硫磷、庚蟲磷、硫線磷標準品(百靈威有限公司)；實驗藥材樣品：金銀花、菊花、槐花、山楂、葛根、干姜、枸杞(經福建中醫(yī)藥大學范世明教授鑒定)；有機磷適配體序列5′-AAG CTT GCT TTA TAG CCT GCA GCG ATT CTT GAT CGG AAA AGG CTG AGA GCT ACG C-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司制備合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備納米金：取1 mL 1%氯金酸溶液用超純水稀釋至100 mL，倒入錐形瓶中放入磁力攪拌子，轉速調至最低，加熱至溶液沸騰。然后，將攪拌速度調至600 r/min，快速加入3 mL 1%檸檬酸三鈉溶液至煮沸的氯金酸溶液中，反應15 min。反應結束后，待顏色不再變化時，移除熱源,繼續(xù)攪拌待溫度降至室溫后，過0.22 μm濾膜，即得納米金膠體溶液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.2.2 適配體納米金比色法檢測多種有機磷農藥為滿足現場快速檢測需要，檢測過程在室溫下進行。在96孔板中加入150 μL納米金溶液和30 μL適配體，混合均勻后，室溫孵育15 min；分別加入30 μL不同濃度的靶標標準液，室溫孵育20 min；再向孔中加入30 μL 200 mmol/L氯化鈉溶液并混合均勻。通過肉眼即可觀察到明顯的溶液顏色變化。

1.2.3 特異性試驗根據文獻[17]確定待測有機磷農藥甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷、水胺硫磷的類似物馬拉硫磷、辛硫磷、庚蟲磷、硫線磷、樂果作為方法的特異性考察對象，對傳感器進行檢測。

1.2.4 實際樣品檢測以常用藥食同源藥材金銀花、菊花、槐花、山楂、葛根、干姜、枸杞為檢測樣品，每個樣品選3批不同產地的藥材。

樣品前處理：取藥材樣品，粉碎，過100目篩，混勻，取5 g于50 mL離心管中，加入30 mL甲醇，先漩渦振蕩1 min，然后以4 000 r/min離心8 min。取5 mL上清液加入15 mL離心管中(事先加入PSA 125 mg、無水硫酸鎂300 mg)，然后渦旋振蕩1 min，于4 000 r/min離心5 min，取上清液，待測。

2 結果與討論

2.1 納米金的表征結果

新制備的檸檬酸三鈉還原納米金溶液為顏色鮮艷的酒紅膠體溶液(圖2A)，其特征吸收峰在520 nm處，峰形較尖銳，表明新制備的金納米粒子性能較好，粒徑均勻。用H7650透射電鏡對納米金顆粒的外觀形態(tài)進行表征(圖2B)，發(fā)現納米金粒子表觀呈統(tǒng)一的圓球形，粒徑均一，分布也比較均勻。使用粒徑儀對其進行檢測，得其平均粒徑為18.74 nm。以上結果表明本次合成的納米金色澤均勻，分散性良好，粒徑均一，具有穩(wěn)定的性質，符合實驗要求。

圖3 納米金溶液體積的選擇Fig.3 Volume selection of nano gold solution

2.2 實驗條件優(yōu)化

2.2.1 納米金溶液體積的選擇納米金溶液是整個檢測體系的顏色指示劑，其在系統(tǒng)中的比例直接影響檢測方法的靈敏度。為獲得可通過肉眼明顯鑒別的顏色，通過向溶液中加入30 μL 100 mmol/L NaCl溶液，優(yōu)化納米金在體系中的體積分數(40.0%、50.0%、62.5%、70.0%),結果見圖3，當納米金體積分數小于62.5%時，體系極易變藍；當納米金體積分數為62.5%時，體系剛好由紅色轉變?yōu)樗{紫色；因此選擇納米金體積分數為62.5%，即向反應體系中加入150 μL納米金溶液。

2.2.2 NaCl濃度的選擇金納米粒子會在鹽的誘導下發(fā)生聚集，隨著鹽濃度的增加，金納米粒子的聚集程度會不斷加深，從而使溶液的顏色由酒紅色變?yōu)樽仙?，最終變?yōu)樗{色。鹽濃度過大時，金納米粒子可能會在沒有靶標的情況下直接發(fā)生聚集，鹽濃度過小則會導致金納米粒子發(fā)生部分聚集影響實驗結果，因此需進行鹽(NaCl)濃度優(yōu)化。在最佳(150 μL)納米金溶液體積下，以超純水代替適配體，甲醇代替靶標，再加入30 μL不同濃度(50、100、150、200、300、350 mmol/L)的NaCl溶液，混勻，放置5 min后觀察溶液的顏色并分別測定吸光值。結果表明，隨著NaCl濃度的逐漸增加，金納米粒子發(fā)生聚集的效果越來越顯著，體系顏色由紅色變?yōu)樗{色。當NaCl濃度低于200 mmol/L時，金納米粒子呈紅色，此時的鹽濃度無法使金納米粒子發(fā)生聚集；當NaCl為200 mmol/L時，金納米粒子的吸光度值急劇下降，粒子團聚程度增大。但隨著鹽濃度的增加，核酸適配體對金納米粒子的保護作用不足以抵抗鹽的作用，金納米粒子發(fā)生直接聚集，影響體系的檢測靈敏度。因此，NaCl的最優(yōu)濃度選擇為200 mmol/L。

2.2.3 測試環(huán)境pH值的優(yōu)化適配體與有機磷之間的作用會受到環(huán)境pH值的影響，實驗考察了不同pH值(5.0、6.8、7.4、8.5)的測試環(huán)境對體系靈敏度的影響。結果顯示，當pH值為7.4時，體系的顏色變化最明顯；當pH值低于6.8時，顏色變化直觀效果減弱，可能是由于在酸性環(huán)境下，核酸適配體活性降低，使之保護金納米粒子的能力減弱；當pH值高于8.5時，影響金納米粒子表面檸檬酸根離子，金納米粒子表面的雙電層受到破壞，導致其與適配體間的靜電吸附作用減弱，從而降低了兩者結合的穩(wěn)定性。故選擇實驗環(huán)境的pH值為7.4。

2.2.4 金納米粒子-核酸適配體的反應時間將150 μL納米金溶液與30 μL 0.1 μmol/L核酸適配體混勻，靜置0、5、10、15、20、25 min后，分別加入30 μL 200 mmol/L NaCl，靜置5 min，測定其吸收光譜。結果顯示，隨著核酸適配體-納米金作用時間的逐漸延長，520 nm處的金納米粒子吸收值也逐漸上升，當反應時間至15 min時，其吸收值不再有明顯變化，表明金納米粒子已與核酸適配體充分結合，故最優(yōu)反應時間選為15 min。

2.2.5 適配體濃度的選擇按照檢測靶標的反應體系，固定納米金溶液用量為150 μL，向反應體系加入一系列不同濃度(0、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、3.0 μmol/L)的適配體溶液30 μL，混合均勻，孵育15 min，用30 μL甲醇代替靶標，再向孔中加入30 μL 200 mmol/L NaCl溶液并混合均勻。結果顯示，當適配體濃度為2.0 μmol/L時恰好能保護納米金顆粒在200 mmol/L NaCl溶液下不聚集變藍。因此，選擇最佳適配體濃度為2.0 μmol/L。

2.3 適配體納米金比色法檢測4種有機磷農藥

圖4 適配體納米金比色法檢測4種有機磷實測圖Fig.4 Determination of four organophosphorus spectra by aptamer nanogold colorimetry

本研究所用核酸適配體對甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷、水胺硫磷4種有機磷農藥具有高度親和力，因此，對50、100、200、500、1 000、5 000 μg/L的4種農藥進行檢測，結果見圖4。雖然適配體對4種農藥的檢測存在一定差異，但當農藥質量濃度高于1 000 μg/L時溶液均顯藍色,因此，該方法雖不能對此4種農藥殘留準確定量，但可用于現場快速篩查，為有機磷農藥多殘留的快速半定量檢測提供了一個新方法。

2.4 特異性檢測

實驗選擇馬拉硫磷、辛硫磷、庚蟲磷、硫線磷、樂果考察方法的特異性，當檢測樣品中加入1 000 μg/L的馬拉硫磷、辛硫磷、庚蟲磷、硫線磷和樂果時，體系的顏色和吸光度值基本無變化；而加入1 000 μg/L甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷和水胺硫磷后，體系變藍，肉眼可見，吸光度值也有明顯變化，表明該適配體傳感器對甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷、水胺硫磷4種農藥殘留具有良好的特異性。

2.5 藥材樣品的檢測

在優(yōu)化條件下，采用本方法對市售金銀花、菊花、槐花、山楂、葛根、干姜、枸杞共21批樣品進行檢測，結果在毫州的菊花、山東濰坊的山楂和四川的干姜中檢出4種有機磷殘留量超過1 000 μg/L，其余18批未檢出。

3 結 論

本研究建立了一種基于納米金-適配體同時檢測甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷、水胺硫磷4種有機磷農藥的快速納米金比色檢測方法。該適配體傳感器以納米金為信號傳導元件，通過在納米金粒子表面修飾有機磷適配體，可對4種有機磷農藥進行特異性識別。當4種有機磷殘留總量超過1 000 μg/L時，溶液體系由紅色變?yōu)樗{色，適合現場快速檢測以及樣本的初步篩查，可為有機磷農藥多殘留的快速檢測提供了一種的新思路。