劉付玉，何 利，曹 舒，王 瀟，劉書亮，陳姝娟

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625000)

魚類產(chǎn)品的下腳料占魚鮮總質(zhì)量的1/2，有魚鱗、魚骨和魚鰭等[1]，其中魚鱗最多。魚鱗可在高純度下制備膠原蛋白[2]，是穩(wěn)定的膠原蛋白的來(lái)源。草魚鱗膠原蛋白是一種環(huán)境友好型的可再生天然高分子材料，有較好的分散性和穩(wěn)定能力，是一種良好載體[3]。

納米材料作為新興的功能材料，已成為環(huán)境和生物檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中納米銀是研究最多的材料之一[4]。納米銀材料具有獨(dú)特的表面等離子體共振效應(yīng)[5]、表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)[6]和熒光增強(qiáng)性質(zhì)[7]，在檢測(cè)方面發(fā)揮著重要作用。目前納米銀的常用合成方法有真空冷凝法[8]、化學(xué)還原法[9]、微生物還原法[10]等。其中化學(xué)還原法因可通過控制化學(xué)反應(yīng)速度改變納米銀粒徑的優(yōu)點(diǎn)而得到了較為廣泛的應(yīng)用[11]。采用化學(xué)還原法制備納米銀時(shí)，為增強(qiáng)其穩(wěn)定性，常用十二烷基硫酸鈉、聚甲基乙烯醚[12]等作為保護(hù)劑。但大部分化學(xué)穩(wěn)定劑有較強(qiáng)毒性，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。本文采用綠色安全的草魚鱗膠原蛋白作為穩(wěn)定劑，并以AgNO3為銀源，茶多酚(TP)為還原劑，通過化學(xué)還原法快速合成了草魚鱗膠原蛋白納米銀(Col-nAg)溶膠。

鉻在自然界中廣泛存在，是世界衛(wèi)生組織公布的強(qiáng)致癌物之一。目前，檢測(cè)水中Cr3+的國(guó)標(biāo)方法[13](高錳酸鉀氧化一二苯碳酸二阱分光光度法、硫酸亞鐵鐵滴定法)和火焰原子吸收光譜法[14]均存在前處理復(fù)雜、儀器昂貴、易受其他離子干擾等缺點(diǎn)。本文將Col-nAg溶膠用于水中Cr3+的檢測(cè)，利用反應(yīng)前后Col-nAg溶膠的顏色變化可肉眼直接觀察檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)時(shí)間短(5 min)，操作方便、簡(jiǎn)單，選擇性較強(qiáng)，有望用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)水中Cr3+。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

atoriusCP225D電子天平(Sartorims公司)；HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng)(Millipore公司)；UV-1800PC紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；85-2恒溫磁力攪拌器(金壇市城東新瑞儀器廠)；PB-2B pH計(jì)(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

草魚鱗購(gòu)于四川省雅安市蒼坪山農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；鉻標(biāo)準(zhǔn)液(1 000 mg/L，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)；硝酸銀、重鉻酸鉀、茶多酚(TP)、硝酸、氫氧化鈉、鹽酸、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O(成都市科龍化工試劑廠)。以上試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)用水為超純水。

實(shí)驗(yàn)室自提草魚鱗膠原蛋白，提取方法參照文獻(xiàn)[15]。1%草魚鱗膠原蛋白溶液的配制：以0.5 mol/L的醋酸溶液為溶劑,加入凍干保存的魚鱗膠原蛋白，配制得到1%的草魚鱗膠原蛋白溶液。

1.2 草魚鱗膠原蛋白納米銀溶膠的制備與表征

25 ℃下向三角瓶中加入10 mL 1%草魚鱗膠原蛋白溶液攪拌30 min，將10 mL 0.02 mol/L AgNO3溶液滴加到體系中充分?jǐn)嚢?0 min，恒速滴加2 mol/L TP溶液直至溶膠顏色變?yōu)辄S色，用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，室溫下持續(xù)攪拌30 min，將得到的黃色草魚鱗膠原蛋白納米銀溶膠(Col-nAg溶膠)樣品置于4 ℃條件下避光保存?？疾霢gNO3濃度(0.01、0.02、0.03 mol/L)、pH值(3.0、7.0、11.0)及TP濃度(1、2、4 mol/L)對(duì)Col-nAg溶膠制備的影響，以UV-Vis和TEM對(duì)其進(jìn)行表征。

1.3 Col-nAg溶膠的穩(wěn)定性研究

考察溫度(4、25、40 ℃)、時(shí)間(0、1、2、3、4、5、6、7、10、15、25、30、45、60 d)、磷酸鹽緩沖液濃度(0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mol/L)、電解質(zhì)(NaCl、(NH4)2SO2、Na2SO4)及其濃度(1.0、3.0、5.0 mol/L)對(duì)Col-nAg溶膠穩(wěn)定性的影響。按照“1.2”制備Col-nAg溶膠，測(cè)定其紫外吸光度值。

1.4 Col-nAg溶膠檢測(cè)水中Cr3+

1.5 Col-nAg溶膠在實(shí)際水中的應(yīng)用

對(duì)自來(lái)水和河水進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別取1 mL待測(cè)試樣，向其中加入100 μL質(zhì)量濃度分別為2、5、10 μg/mL的Cr3+溶液混合后，加入1 mL的Col-nAg溶膠充分混勻，反應(yīng)5 min，測(cè)定其紫外吸光度值，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定水樣中Cr3+回收率，每組測(cè)定做6次重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Col-nAg溶膠制備條件優(yōu)化

2.1.1 AgNO3濃度對(duì)Col-nAg溶膠制備的影響圖1A顯示，3個(gè)樣品在410 nm處均有紫外吸收峰，此吸收峰是球形納米銀的特征吸收峰[16]。隨著AgNO3濃度的增大，Col-nAg溶膠顏色變深，吸收峰強(qiáng)度增大，峰形變寬，峰位紅移。原因是銀晶體的形成包括成核和晶體生長(zhǎng)兩個(gè)過程，加入AgNO3前期以成核為主，后期以核生長(zhǎng)為主。一方面，Ag+濃度的上升使前期形成的晶核增多，但后期提供晶核生長(zhǎng)的單質(zhì)銀更多，從而納米銀的粒徑增大，溶膠顏色變深。另一方面，銀晶體濃度的上升，增大了晶粒之間碰撞的機(jī)率，易造成粒徑不均衡分布和變大[17]。因此吸光度值隨AgNO3濃度的增大而增大，合成的溶膠增多，但納米銀粒徑與AgNO3濃度呈正相關(guān)，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)制備Col-nAg溶膠選用AgNO3濃度為0.02 mol/L。

2.1.2 pH值對(duì)Col-nAg溶膠制備的影響圖1B顯示，樣品在410 nm處均有紫外特征吸收峰[16]。pH 3.0時(shí)，溶膠為淺黃色，吸收峰強(qiáng)度較弱，這是因?yàn)門P的還原作用被抑制，制得的納米銀較少。pH 7.0時(shí)，溶膠為明黃色，納米銀未發(fā)生團(tuán)聚，表明Col-nAg溶膠在中性條件下穩(wěn)定。pH 11.0時(shí)，溶膠由黃色變成紅褐色，主要是因?yàn)橛?.01 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，易使反應(yīng)溶液局部堿性過強(qiáng)，導(dǎo)致TP不穩(wěn)定而析出且氧化褐變?yōu)榧t褐色[17]，從而影響Col-nAg溶膠的制備。因此pH 7.0時(shí)，納米銀顆粒分散性、穩(wěn)定性好，故本實(shí)驗(yàn)制備Col-nAg溶膠選用pH值為7.0。

2.1.3 TP濃度對(duì)Col-nAg溶膠制備的影響圖1C顯示，樣品在410 nm處的紫外特征吸收峰強(qiáng)度隨著TP濃度的增大而增大，且吸收峰位置發(fā)生紅移，表明納米銀粒徑增大。TEM結(jié)果與紫外一致，圖2顯示，隨著TP濃度的增大，納米銀的平均粒徑增大，1、2、4 mol/L TP對(duì)應(yīng)的納米銀的粒徑分別為3.35、4.45、7.25 nm。因?yàn)門P濃度增大，還原速度加快，晶粒因不能及時(shí)擴(kuò)散而聚集，粒徑變大。圖2A中納米銀顆粒形貌不規(guī)則，多為非球形。圖2B中為規(guī)則的球形。A,B中的個(gè)別顆粒發(fā)生團(tuán)聚。圖2C中納米銀顆粒為大小均勻的球形，且規(guī)律排序，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，原因在于高濃度的TP對(duì)納米銀有穩(wěn)定、分散的作用[18]。草魚鱗膠原蛋白對(duì)納米銀顆粒規(guī)則的形貌和優(yōu)良的分散性也有一定影響[19]，膠原蛋白結(jié)構(gòu)中的—OH、—COOH和—NH2通過與納米銀功能性基團(tuán)之間的靜電、氫鍵及共價(jià)鍵作用緊密結(jié)合形成聚合物層[20]，包裹住納米銀使晶核穩(wěn)定分布、有限擴(kuò)散生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著TP濃度增加，納米銀粒徑變大，且高濃度TP下納米銀分散性更好，為滿足納米銀顆粒有良好分散性的同時(shí)平均粒徑較小、形貌規(guī)則，本實(shí)驗(yàn)選用2 mol/L 的TP 制備Col-nAg溶膠。

圖1 不同AgNO3濃度(A)、pH值(B)和TP濃度(C)下制備的Col-nAg溶膠的UV-Vis圖Fig.1 UV-Vis charts of Col-nAg sols with different AgNO3 concentrations(A),pH(B) and TP concentrations (C)

2.2 Col-nAg溶膠的穩(wěn)定性分析

2.2.1 溫度/時(shí)間對(duì)Col-nAg溶膠的影響圖3A顯示，在4 ℃時(shí)，Col-nAg溶膠相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)比第60 d與第1 d的樣品，發(fā)現(xiàn)溶膠顏色無(wú)顯著變化，紫外吸光度值基本一致。25 ℃時(shí)，60 d后納米銀部分析出，溶膠顏色變灰，這是因?yàn)槟z原蛋白分子運(yùn)動(dòng)速度加快，納米銀顆粒與活性基團(tuán)之間的氫鍵作用減弱導(dǎo)致析出。40 ℃時(shí)，膠原蛋白已變性(草魚鱗膠原蛋白變性溫度為34.5 ℃)，Col-nAg溶膠完全沉淀[20]。故Col-nAg溶膠在4 ℃、60 d內(nèi)穩(wěn)定。

圖2 1 mol/L(A)、2 mol/L(B)、4 mol/L(C)TP濃度下Col-nAg溶膠的TEM圖及對(duì)應(yīng)的粒徑分布圖Fig.2 Col-nAg sol TEM and particle size distribution diagrams with 1 mol/L(A),2 mol/L(B) and 4 mol/L(C) TP

2.2.2 磷酸鹽緩沖液濃度對(duì)Col-nAg溶膠的影響圖3B顯示，pH 7.0時(shí)，隨著磷酸鹽緩沖液濃度的增大，Col-nAg溶膠的吸光度值無(wú)明顯變化，表明不同濃度的磷酸鹽緩沖液對(duì)溶膠穩(wěn)定性無(wú)明顯影響。

2.2.3 電解質(zhì)對(duì)Col-nAg溶膠的影響圖3C顯示，3種電解質(zhì)對(duì)Col-nAg溶膠穩(wěn)定性的影響基本相同。電解質(zhì)濃度為1、2、3 mol/L時(shí)，溶膠紫外吸光值稍有增大，因?yàn)橹苽銫ol-nAg溶膠時(shí)，少量電解質(zhì)存在有助于納米銀膠團(tuán)雙電層和膠粒電勢(shì)的形成，對(duì)溶膠的穩(wěn)定性具有促進(jìn)作用。當(dāng)電解質(zhì)濃度為4 mol/L或5 mol/L時(shí)，吸光度值降低，這是因?yàn)樵龆嗟耐饧与娊赓|(zhì)奪取了納米銀顆粒所帶的電荷，使得溶膠團(tuán)被破壞，發(fā)生聚沉[22]。因此低濃度的電解質(zhì)對(duì)Col-nAg溶膠穩(wěn)定性有促進(jìn)作用，而高濃度有破壞作用。所以，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中電解質(zhì)均設(shè)置為1 mol/L的NaCl。

2.3 Col-nAg溶膠檢測(cè)水中Cr3+的結(jié)果分析

2.3.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化溶液酸度會(huì)影響Ag+表面電荷和金屬離子的水解狀態(tài)，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH 3.0～6.0時(shí)，Col-nAg溶膠吸光度值變化不大，可能是因?yàn)镃ol-nAg溶膠中草魚鱗膠原蛋白表面基團(tuán)的作用使得即使酸度增加也不影響Cr3+的檢測(cè)。pH 8.0～11.0時(shí)，吸光度值略有增大，但堿性條件下Col-nAg溶膠中的TP不穩(wěn)定且易析出氧化褐變[17]。pH 6.0～8.0時(shí)，吸光度值比酸性條件下高，且pH 7.0時(shí)納米銀更穩(wěn)定，而待測(cè)樣品pH值較易調(diào)節(jié)為7.0，故本實(shí)驗(yàn)選用檢測(cè)pH值為7.0。

圖3 不同溫度和時(shí)間(A)、磷酸鹽緩沖液濃度(B)和電解質(zhì)濃度(C)下Col-nAg溶膠的UV-Vis圖Fig.3 UV-Vis charts of Col-nAg sols with different temperatures and time(A),phosphate buffer concentrations(B) and electrolyte concentrations(C)

溫度為20 ～30 ℃時(shí)，Col-nAg溶膠吸光度值無(wú)明顯變化。4 ℃時(shí)，吸光度值有所減小，是因?yàn)榉磻?yīng)溫度太低，Col-nAg溶膠與Cr3+反應(yīng)速度緩慢且沒有充分反應(yīng)。40 ℃時(shí)，吸光度值增大，是因?yàn)椴蒴~鱗膠原蛋白在40 ℃時(shí)已變性，納米銀顆粒聚集。結(jié)果顯示，20 ～30 ℃有利于Col-nAg溶膠檢測(cè)Cr3+，故本實(shí)驗(yàn)選用檢測(cè)溫度為25 ℃。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間在1～5 min內(nèi)時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Col-nAg溶膠吸光度值不斷增大，5 min時(shí)達(dá)到最大。在5～60 min時(shí)，吸光度值保持最大且穩(wěn)定。表明Col-nAg溶膠與Cr3+在5 min時(shí)反應(yīng)完全，故本實(shí)驗(yàn)選用檢測(cè)時(shí)間為5 min。

2.3.2 Col-nAg溶膠檢測(cè)水中Cr3+取1 mL Col-nAg溶膠3份，分別與超純水、Cr3+和Cr6+溶液等體積混合，反應(yīng)5 min。發(fā)現(xiàn)加入Cr3+后溶膠顏色變?yōu)楹稚?，而其他溶膠顏色無(wú)變化。

圖4 Col-nAg溶膠比色檢測(cè)Cr3+的機(jī)理Fig.4 Mechanism of Col-nAg sol colorimetric detection of Cr3+

對(duì)樣品進(jìn)行UV-Vis表征，發(fā)現(xiàn)加入Cr6+的溶膠吸收峰未紅移，但吸收峰強(qiáng)度增大。而Cr3+的吸收峰紅移及吸收峰強(qiáng)度變化最大，對(duì)其進(jìn)行TEM表征，發(fā)現(xiàn)加入Cr3+后，納米銀顆粒發(fā)生團(tuán)聚，粒徑變大，這是因?yàn)槟z原蛋白的—COOH與Cr3+發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)(圖4)，破壞了Col-nAg溶膠的穩(wěn)定性，使納米銀發(fā)生團(tuán)聚，銀納米顆粒特有的表面等離子共振峰發(fā)生變化，從而導(dǎo)致納米銀的顏色改變(從黃色變?yōu)楹稚?，并發(fā)生紫外吸收的變化[23]，因此根據(jù)溶膠紫外吸收值的變化與Cr3+濃度的關(guān)系建立了一種肉眼觀測(cè)和定量檢測(cè)水中Cr3+的檢測(cè)方法。

2.3.3 Cr3+濃度對(duì)檢測(cè)的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在410 nm處，隨著Cr3+濃度的增加，Col-nAg溶膠紫外吸收峰強(qiáng)度增大，峰位紅移。因?yàn)镃r3+改變了納米銀所在的化學(xué)環(huán)境，且Cr3+的濃度越大，膠原蛋白和Cr3+的作用越強(qiáng)。結(jié)果顯示，Col-nAg溶膠的吸收峰強(qiáng)度(Y)與Cr3+質(zhì)量濃度(X)在0～10 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.11 416X-0.03 044，r2=0.994。根據(jù)空白樣品信噪比的3倍(S/N=3)計(jì)算Col-nAg溶膠對(duì)Cr3+的檢出限為0.5 μg/mL。與其它檢測(cè)Cr3+的方法比較(表1)發(fā)現(xiàn)，該方法具有反應(yīng)時(shí)間短(5 min)、樣品前處理簡(jiǎn)單、無(wú)需昂貴儀器、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

表1 與其他Cr3+的檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison with other methods for Cr3+ detection

2.3.4 Col-nAg溶膠選擇性研究考察了水中常見離子的干擾情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Cr3+濃度為10 μg/mL，誤差為±0.1%的條件下，1倍的“1.4”中所述陰離子和1倍的金屬陽(yáng)離子均不干擾測(cè)定。而5倍和10倍的“1.4”中所述金屬陽(yáng)離子中Cu2+有一定程度的干擾，可通過電化學(xué)法去除。

2.4 Col-nAg溶膠在實(shí)際水樣中的應(yīng)用

分別對(duì)自來(lái)水和河水進(jìn)行2、5、10 μg/mL 3個(gè)水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行實(shí)驗(yàn)6次，結(jié)果顯示，自來(lái)水的回收率為83.0%～97.6%，河水為81.0%～97.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不超過3.0%。準(zhǔn)確度達(dá)到生活飲水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[24]國(guó)標(biāo)要求，有望用于實(shí)際污水樣品中Cr3+的快速檢測(cè)。

表2 自來(lái)水和河水測(cè)定結(jié)果(n=6)Table 2 Detection results of tap water and river water (n=6)

3 結(jié) 論

以草魚鱗膠原蛋白為穩(wěn)定劑，AgNO3為銀源，TP為還原劑，采用化學(xué)還原法合成Col-nAg溶膠。當(dāng)制備條件為0.02 mol/L AgNO3，pH 7.0和2 mol/L TP時(shí)，可獲得平均粒徑為4.45 nm，分布均勻、性質(zhì)穩(wěn)定的納米銀溶膠。將其用于比色法快速檢測(cè)水中Cr3+，可在適宜條件下(pH 7.0，25 ℃)，快速 (響應(yīng)時(shí)間5 min)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出樣品中Cr3+含量。該方法對(duì)Cr3+的檢出限為0.5 μg/mL，具有選擇性好、無(wú)需昂貴儀器、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)工作中。