藍(lán) 草，邵琳智*,陳思敏

(1.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

“愛美之心，人皆有之”。隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展，化妝品種類越來越多，人們的日常生活已然離不開化妝品，同時也對化妝品的功效和質(zhì)量提出了更高要求。某些廠商為使產(chǎn)品具有消炎祛痘等功效，違法添加抗生素、糖皮質(zhì)激素類化合物。氯霉素是一種廣譜抗生素，具有殺菌消炎作用，使用后能明顯改善膚質(zhì)。然而，長期使用則會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，可引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病,對人類健康構(gòu)成潛在危害[1-2]。因此，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[3]規(guī)定氯霉素不得作為生產(chǎn)原料及組分添加到化妝品中。目前，檢測化妝品中氯霉素的常用方法有高效液相色譜法[2,4-5]和液相色譜-質(zhì)譜法[1,6-8]，但這些方法的樣品前處理復(fù)雜、費時，分析時間長、基質(zhì)干擾較強(qiáng)，易造成色譜和質(zhì)譜系統(tǒng)的污染，不利于快速篩查。而常用的酶聯(lián)免疫法、放射免疫法等快速篩查方法則普遍存在假陽性率高、靈敏度低、普適性差等缺點。

“綠色”、“快速”、“無損”、“原位”是分析檢測行業(yè)新的發(fā)展方向，近年來以原位電離技術(shù)為主要標(biāo)志的敞開式離子化質(zhì)譜(AIMS)得到了迅猛發(fā)展。原位電離技術(shù)包括實時直接分析(DART)、液滴萃取表面分析(LESA)、高速激光熱解析化學(xué)電離(LDTD)、電噴霧萃取離子源(EESI)、解吸附電暈束離子源(DCBI)等,其中DART無需或只需簡單的樣品前處理，具有實時、原位、高通量、簡便快速、環(huán)保、可與各種質(zhì)譜儀聯(lián)用等優(yōu)點，同時兼具傳統(tǒng)質(zhì)譜的分析速度快、靈敏度高等特點，已被應(yīng)用于食品藥品非法添加、司法鑒定、成分分析等領(lǐng)域[9-14]。靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(Q-Exactive-Orbitrap-MS)技術(shù)在其掃描質(zhì)量范圍內(nèi)可提供目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)，具有質(zhì)量分辨率高，數(shù)據(jù)庫建立和軟件檢索方便，樣品基質(zhì)干擾極少，無需設(shè)定時間窗口，以及操作便利等優(yōu)點，在篩查定性、定量分析中具有廣泛的前景。

本研究采用實時直接分析-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(DART-Q-Exactive-Orbitrap-MS)建立了化妝品中氯霉素的快速檢測方法。該方法無需復(fù)雜的樣品前處理和耗時的色譜分離，減少了對化學(xué)溶劑的消耗，大幅縮短了樣品分析周期且可避免基質(zhì)干擾[15-16]。同時，能得到具有精確質(zhì)量數(shù)的準(zhǔn)分子離子峰和豐富的碎片離子，能夠快速、準(zhǔn)確地測定各種基質(zhì)化妝品中的氯霉素含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive靜電場軌道阱質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)，實時直接分析離子源DART SVP(美國Ion Sense公司)；BT 124S分析天平(德國Sartorius公司)；1-14高速離心機(jī)、3-30K高速離心機(jī)(德國Sigma公司)，MS3 basic旋渦振蕩器(德國 IKA公司)；SW 30H超聲波水浴(瑞士SONO SWISS公司)。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CAS號：56-75-7)的純度為99.2%，購自德國Dr.E公司；乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇(HPLC級，美國Fisher Scientific公司)；甲酸(HPLC級，德國Merck公司)；所用試劑除注明外均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品約25 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.3 樣品預(yù)處理

稱取0.5 g試樣(準(zhǔn)確至0.01 g)于15 mL離心管中，加入1.0 mL乙醇置于超聲波水浴中超聲5 min，渦旋振蕩10 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管中，加入0.5 mL水，渦旋混勻，以10 000 r/min離心5 min，取上清液待測。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，稱取0.5 g試樣于15 mL離心管中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(可逐級稀釋)，配制成質(zhì)量濃度為0、2.0、5.0、10、20、50、100 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置30 min，按“1.3”進(jìn)行預(yù)處理后，供質(zhì)譜測定。以測得的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5 實驗條件

DART源條件：負(fù)離子模式，離子化氣體為高純氦氣，氦氣流速為3 L/min，離子化溫度為500 ℃；采用12 Dip-it Samplers模式進(jìn)樣，用移液槍吸取1 μL溶液點于玻璃棒下端置于自動進(jìn)樣架上進(jìn)樣，進(jìn)樣速度為0.3 mm/s，離子源出口距質(zhì)譜進(jìn)口約10 mm。

質(zhì)譜條件：負(fù)離子化模式；一級全掃描(Full MS)質(zhì)量范圍：m/z100～1 000；分辨率：70 000；吹掃氣流速：7 L/min；離子最大容納數(shù)量(AGC target):1×106；離子最大注入時間：100 ms；平行反應(yīng)監(jiān)測模式(PRM)掃描分辨率：17 500,離子最大容納數(shù)量:2×105；離子最大注入時間：100 ms。 氯霉素母離子：m/z321.005 1,子離子：m/z152.035 5和121.029 4，歸一化碰撞能量(NCE)：35 eV。

圖1 NCE為35 eV時氯霉素的二級質(zhì)譜圖Fig.1 MS2 spectrum of chloramphenicol in NCE at 35 eV

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氯霉素分子結(jié)構(gòu)中含有氯離子，在負(fù)離子監(jiān)測模式下靈敏度較高。吸取1 μL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液點于玻璃棒下端進(jìn)行一級全掃描-二級質(zhì)譜全掃描(Full MS/dd-MS2)模式掃描，考察歸一化碰撞能量(NCE)分別為10、20、35、45、60 eV時對氯霉素二級質(zhì)譜的影響，結(jié)果表明在歸一化碰撞能量為35 eV時能夠得到較好的二級質(zhì)譜圖(如圖1)。分別選擇響應(yīng)較高的152.035 5和121.029 4兩個子離子作為定量和定性離子進(jìn)行Full MS-PRM模式掃描。

2.2 DART條件的優(yōu)化

2.2.1 離子化溫度DART離子源需要高溫使激發(fā)態(tài)的惰性氣體解析并瞬間離子化待測化合物，因此離子化溫度是非常重要的參數(shù)。過高和過低的溫度均會影響DART的離子化效率和背景噪音，高溫會加速待測樣品的熱解吸率，使更多的待測樣品進(jìn)入質(zhì)譜檢測器，進(jìn)而增強(qiáng)響應(yīng)。然而，過高的溫度會導(dǎo)致待測樣品在熱解吸過程中降解，反而降低靈敏度[17]。本研究考察了離子化溫度分別為300、400、500 ℃時氯霉素的響應(yīng)情況，結(jié)果表明當(dāng)離子化溫度為500 ℃時氯霉素的響應(yīng)是400 ℃時的2倍，是300 ℃時的5倍，因此選擇離子化溫度為500 ℃。

2.2.2 樣品傳輸速度DART軟件能控制線性軌道上Dip-it玻璃棒的移動速度，從而控制待測樣品在離子化區(qū)域的停留時間，因此傳輸速度對樣品的峰形和響應(yīng)強(qiáng)度有較大影響。本研究考察了傳輸速度分別為0.3、0.5、1.0 mm/s時氯霉素兩對子離子的峰形和離子響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果表明，樣品傳輸速度越快，目標(biāo)離子的峰形越尖銳，但當(dāng)傳輸速度過快時，離子化氣體與樣品的接觸時間過短，導(dǎo)致離子化效率低，響應(yīng)降低。由于樣品傳輸速度為0.3 mm/s的響應(yīng)和0.5 mm/s時差別不大，但掃描點數(shù)多于后者，且信號更穩(wěn)定，定量也更準(zhǔn)確，因此選擇樣品傳輸速度為0.3 mm/s。

2.2.3 樣品溶劑考察了分別以甲醇、乙醇、乙醇-水(1∶1，體積比)和乙醇-0.1%甲酸水溶液(1∶1，體積比)為樣品溶劑時對氯霉素響應(yīng)的影響，結(jié)果表明，以乙醇-水(1∶1)為樣品溶劑時氯霉素的響應(yīng)最高，峰形更尖銳，可能是因為水的加入使液滴更不易揮發(fā)和擴(kuò)散，離子化效率好。因此，本研究選用乙醇-水(1∶1)作為上樣溶劑。

2.2.4 進(jìn)樣量Dip-it進(jìn)樣模塊一般采用蘸取方式，但蘸取進(jìn)樣的重現(xiàn)性較差，因此本方法采用移液槍定量點取的方式進(jìn)樣，分別研究了1 μL和2 μL進(jìn)樣量對氯霉素響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，進(jìn)樣量為1 μL時的峰形更尖銳，響應(yīng)約為2 μL進(jìn)樣量時的3倍，可能是因為2 μL進(jìn)樣量過多，液滴向下流動或向玻璃棒后方擴(kuò)散，導(dǎo)致峰形擴(kuò)散，而1 μL進(jìn)樣量能夠保證液滴的完整。因此，實驗采用移液槍定量點取1 μL樣品溶液進(jìn)樣，重現(xiàn)性能夠滿足實驗要求。

2.3 線性關(guān)系與定量下限

按照“1.4”方法繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果顯示氯霉素在0～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=8.46×105X-1.36×106，相關(guān)系數(shù)r=0.998 4。在空白樣品中添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行測定，以信噪比S/N≥10且回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》[18]要求時的質(zhì)量濃度為定量下限。由于高分辨質(zhì)譜得到的氯霉素信噪比非常大，因此根據(jù)上述規(guī)范的要求將本方法的定量下限定為3.0 mg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

采用兩個不同品牌的化妝水、面霜、面膜空白樣品，分別添加3個水平(3.0、6.0、30 mg/kg)的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行檢測，每個加標(biāo)水平重復(fù)測定6個樣品(見表1)。結(jié)果表明氯霉素的回收率為70.2%～119%，平均回收率為81.6%～98.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為8.4%～17%。

表1 化妝品中氯霉素的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 1 Spiked recoveries and RSDs of chloramphenicol in cosmetics(n=6)

2.5 實際樣品分析

采用本方法對50個祛痘類化妝品進(jìn)行檢測，其中11個樣品檢出氯霉素，檢出含量為40～19 400 mg/kg。同時采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[3]的高效液相色譜法測定該50個樣品，結(jié)果一致，表明本方法有較好的準(zhǔn)確度。但與本方法相比，采用高效液相色譜法耗時較長，譜圖復(fù)雜且易受基質(zhì)干擾。

3 結(jié) 論

本研究采用 DART-Q-Exactive-Orbitrap-MS建立了一種化妝品中氯霉素的快速定量分析方法。樣品經(jīng)簡單的前處理后直接進(jìn)樣，無需色譜分離，十幾秒內(nèi)即可完成數(shù)據(jù)分析與采集，且不易受基質(zhì)干擾，實驗結(jié)果與高效液相色譜法的分析結(jié)果一致,具有很好的可靠性。