張慧文，宋曉玲，石松利，張莎莎，梁 越，王煥蕓*

1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110 2. 包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017

引 言

蓽茇(PiperlongumL.)是藥食同源性中藥，也是蒙、藏、維醫(yī)的習(xí)用藥材[1]。其辛，熱，歸胃、大腸經(jīng)?，F(xiàn)代藥理研究表明蓽茇具有抗氧化、降血脂等藥理活性，臨床常用于治療胃痛、腹瀉等消化系統(tǒng)疾病[2]，日常被用作香料或調(diào)味劑。蓽茇富含多種酰胺類生物堿，《中國(guó)藥典》采用高效液相色譜法檢測(cè)胡椒堿[3]，已有文獻(xiàn)報(bào)道了其中蓽茇寧的含量檢測(cè)，這些質(zhì)量控制方法缺乏整體性和創(chuàng)新性[4]。

中藥材以多組分整體入藥，其中單個(gè)或幾個(gè)目標(biāo)成分的檢測(cè)和控制難以反映藥材質(zhì)量，因此人們采用紅外或HPLC指紋圖譜等方法進(jìn)行藥材的整體性分析。蓽茇的HPLC指紋圖譜具有整體性，可全面反映藥材質(zhì)量，但是需要大量的標(biāo)準(zhǔn)品才能確定其成分含量，蓽茇的化學(xué)成分中僅胡椒堿有市售標(biāo)準(zhǔn)品，其余成分均需自行制備。標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏制約了蓽茇的含量測(cè)定和深入研究。而紅外光譜具有快速、高效、用量少，操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，宏觀整體特征性強(qiáng)，可以補(bǔ)充HPLC指紋圖譜的不足。聯(lián)合應(yīng)用傅里葉紅外光譜法和HPLC指紋圖譜對(duì)4個(gè)產(chǎn)地6批次的蓽茇進(jìn)行分析，為蓽茇的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種有效的方法，用以控制中醫(yī)臨床用藥質(zhì)量，并為蓽茇的食品安全提供保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與參數(shù)

Thermo Ultimate3000 DGLC雙三元梯度高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher)； NICOLET-6700傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher)； JP-031S型超聲波清洗儀(中國(guó)深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)； 多功能粉碎機(jī)(中國(guó)浙江高鑫工貿(mào)有限公司)； BT25S型微量電子分析天平(十萬分之一，美國(guó)Sartorius)； GenePureUV/UF-TOC超純水儀(美國(guó)Thermo Fisher)。

1.2 試劑

胡椒堿購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司(批號(hào)： MUST-17041301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，蓽茇寧為實(shí)驗(yàn)室自制。溴化鉀為光譜純，甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑為分析純。

1.3 樣品制備

蓽茇分別購(gòu)自于云南、亳州、廣西和海南，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥教研室張慧文博士鑒定為胡椒屬植物蓽茇。生產(chǎn)批號(hào)見表1。

表1 不同產(chǎn)地蓽茇的主要信息

2.4 HPLC指紋圖譜的測(cè)定

精密稱取1.0 g蓽茇，25 mL 70%甲醇超聲提取30 min，過濾，得供試品溶液。色譜條件如下： 色譜柱： Welch Ultimate LP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司)； 流速： 1 mL·min-1； 進(jìn)樣量： 10 μL； 柱溫： 30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)： 254 nm； 流動(dòng)相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～8 min，80%～83%A； 8～11 min，83%～85%A； 11～15 min，85%～95%A； 15～30 min，95%A)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蓽茇的紅外光譜研究

2.1.1 蓽茇紅外指紋圖譜和數(shù)據(jù)

蓽茇藥材分別經(jīng)干燥、粉碎后，過60目篩，與KBr粉末混合研磨，壓片，放入FTIR儀中測(cè)定。蓽茇藥材的紅外光譜較為復(fù)雜，是由多種化學(xué)成分的吸收光譜重疊形成。3 000～3 500 cm-1是由于苯環(huán)上C—H的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的； 2 926 cm-1附近為不飽和碳上C—H的伸縮振動(dòng)； 2 855 cm-1為—CH2基的對(duì)稱伸縮振動(dòng)； 1 637 cm-1是烯烴的C—C伸縮振動(dòng)； 1 558，1 490和1 445 cm-1為苯環(huán)的特征譜帶； 1 253 cm-1是六氫吡啶環(huán)上C—H彎曲振動(dòng)。

胡椒堿的紅外光譜中，3 009.34 cm-1是苯環(huán)上C—H的伸縮振動(dòng)； 2 940.40 cm-1是不飽和碳上C—H的伸縮振動(dòng)； 1 634.40 cm-1為較寬的中強(qiáng)吸收峰，是酰胺基特征吸收峰，由于共軛造成紅移，強(qiáng)度增加； 1 583.99，1 491.73和1 448.77 cm-1為苯環(huán)的特征譜帶，由于共軛，波數(shù)降低，而強(qiáng)度增強(qiáng)； 1 252.93 cm-1為六氫吡啶環(huán)上C—H彎曲振動(dòng)； 1 611.98 cm-1是羰基特征吸收峰。蓽茇寧的紅外光譜中，3 290.24 cm-1是N—H伸縮振動(dòng)吸收峰； 1 645.02 cm-1為羰基伸縮振動(dòng)吸收峰； 1 549.92，1 503.92，1 489.09 cm-1為苯環(huán)上的骨架C伸縮振動(dòng)； 2 985.98和2 871.02 cm-1為烷基上C—H的對(duì)稱、不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。

圖1 蓽茇、胡椒堿和蓽茇寧的紅外光譜圖

表2 不同產(chǎn)地蓽茇紅外指紋圖譜吸收峰

續(xù)表2

S42 931.332 855.852 066.451 772.791 751.75S52 925.772 855.572 093.692 064.83S62 926.812 854.442 067.071 871.291 773.371 751.85S11 655.421 637.491 614.351 592.231 545.161 503.071 490.58S21 734.671 654.131 632.771 617.51 546.61 503.971 491.53S31 737.721 658.281 622.111 613.51 558.361 516.021 490.09S41 733.161 651.491 632.51 624.941 560.891 512.561 491.37S51 734.711 654.291 630.211 560.711 504.071 491.18S61 734.731 654.031 632.631 560.661 511.991 491.79S11 445.781 387.921 367.71 319.931 253.021 194.5S21 448.471 401.211 386.341 316.681 276.331 252.82S31 447.321 400.941 318.071 275.861 252.58S41 448.531 401.171 386.481 317.861 278.471 252.69S51 445.391 401.241 385.331 319.111 251.61S61 448.981 401.31 277.531 252.73S11 156.581 135.221 117.491 080.571 034.861 020.82998.68S21 134.581 115.6999.32S31 134.611 114.2S41 134.651 115.28S51 134.37S61 152.761 134.921 068.43S1929.44858.16767.02703.94680.77668.18646.32S2929.97847.46831.5763.82678.97668.38634.74S3930.33847.73831.83781.33678.94668.07635.59S4930.16847.25830.83679.23668.31632.85S5929.29854.25763.81668.74638.81S6929.84847.34831.08678.7668.44624.02S1609.34573.96527.09523.82480.44436.61S2615.78534.84517.65474.1S3616.38536.29473.63422.83S4611.48531.57461.72423.66S5616.9576.91532.17428.86S6607.35531.6516.62473.38427.95

2.1.2 共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列

依據(jù)紅外光譜共有峰率和變異峰率計(jì)算公式[5]，建立蓽茇的雙指標(biāo)分析序列(表3)。廣西產(chǎn)蓽茇(S3和S4)的共有峰率最高為82%，亳州(S2)和廣西產(chǎn)蓽茇(S3和S4)的共有峰率均較高，分別為79%和80%； 樣品S6與樣品S2，S3，S4共有峰率較高為73%, 74%, 76%。樣品S1與其他樣品的共有峰率是最低的，而變異峰率是最高的，提示S1與其他樣品的差異較大。

2.2 蓽茇的指紋圖譜研究

使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012》分析，標(biāo)定17個(gè)指紋圖譜共有特征峰，相似度結(jié)果均大于0.96，相似度良好。由于2號(hào)峰(胡椒堿)的重現(xiàn)性和分離度都較好，峰形對(duì)稱，峰面積較大，因此將胡椒堿的色譜峰定為參照峰(S峰)。HPLC指紋圖譜結(jié)果表明各產(chǎn)地蓽茇藥材所含成分基本相同(在254 nm下測(cè)定)，其中胡椒堿是含量最大的生物堿，但從峰面積看，含量大小有所區(qū)別。蓽茇中胡椒堿和蓽茇寧的含量在4個(gè)產(chǎn)地中，安徽亳州和廣西較高。

3 結(jié) 論

同時(shí)采用傅里葉紅外光譜法和HPLC指紋圖譜考察4個(gè)產(chǎn)地6批次蓽茇，結(jié)果顯示兩種分析方法對(duì)藥材評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，各批次蓽茇的化學(xué)成分基本相同，質(zhì)量比較穩(wěn)定，其中云南產(chǎn)蓽茇(S1)與其余5批次蓽茇有一定差異。中藥紅外光譜中包含多種化學(xué)成分的重疊峰，需要建立共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列，從整體上評(píng)價(jià)藥材品質(zhì)。結(jié)果表明紅外光譜與HPLC指紋圖譜均能從化學(xué)成分的角度評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量，具有整體性和綜合性[6]，指紋圖譜僅顯示在固定波長(zhǎng)條件下有紫外吸收的化合物，同時(shí)紅外光譜具有多種優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)便、無化學(xué)污染、分析速度快等，因此紅外光譜在分析復(fù)雜中藥的成分體系中更具有優(yōu)勢(shì)。

表3 不同產(chǎn)地蓽茇的雙指標(biāo)序列

圖2 蓽茇的HPLC指紋圖譜

表4 指紋圖譜相似度結(jié)果

表5 胡椒堿和蓽茇寧的含量

蓽茇的HPLC指紋圖譜顯示有17個(gè)共有峰，其中含量最大的是胡椒堿，相似度結(jié)果表明云南產(chǎn)蓽茇(S1)與其余5批次蓽茇差異略大，其結(jié)果與紅外光譜結(jié)果相同。同時(shí)進(jìn)行了主要成分胡椒堿和蓽茇寧的含量檢測(cè)，云南(S1)和海南(S5，S6)產(chǎn)蓽茇中胡椒堿和蓽茇寧含量較低，而安徽亳州(S2)和廣西(S3，S4)的含量較高，與紅外光譜和HPLC指紋圖譜的結(jié)果有一定的差異，說明中藥材的質(zhì)量控制方法應(yīng)考慮整體性。將紅外光譜和HPLC指紋圖譜聯(lián)合應(yīng)用于蓽茇的質(zhì)量控制研究，兩種方法互為補(bǔ)充，操作簡(jiǎn)便，樣品使用量少，可做為藥材快速鑒別的新方法，為蓽茇的化學(xué)成分、質(zhì)量控制和開發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和依據(jù)。